一种原核糖核苷酸合成酶的分子改造研究及其在稀有糖核苷酸合成中的应用

GlmU-Tr229是一种原核来源的糖核苷酸合成酶，能够催化合成具有重要价值的氨基糖核苷酸UDP-GlcNAc；但该类酶对底物的选择具有局限性，不能催化稀有糖核苷酸的合成，影响了糖基化工程和糖药物的研究发展。项目申请通过对具有潜在底物选择广泛性的GlmU-Tr229进行理性设计和分子改造，拓宽底物选择能力，酶法合成稀有糖核苷酸，丰富糖核苷酸类化合物的应用范围。拟采用生物信息学预测蛋白质结构中与底物选择性相关的重要氨基位点；对关键位点进行点突变、点饱和突变及区域片段插入突变来拓宽酶的底物选择性；检测突变酶的稀有糖核苷酸合成能力，筛选突变酶并合成系列稀有糖核苷酸；将产物应用于糖基转移酶反应，合成重要寡糖的衍生物。本项目研究将填补国际上糖核苷酸合成酶与底物选择性相关位点研究及分子改造糖核苷酸合成酶制备稀有糖核苷酸的空白，并将对糖物质资源库、糖基化工程、糖药物的研究与产业化起到推动作用。

糖核苷酸是单糖的还原端和核苷一磷酸或二磷酸的末端磷酸基团结合形成的化合物。糖核苷酸作为Leloir型糖基转移酶的供体底物，参与生物体内糖链及糖缀合物的合成。近年来，在一些生物体内发现了部分稀有糖核苷酸。本项目以已有的糖核苷酸酶法合成研究为基础，通过对糖核苷酸合成酶进行筛选和分子改造，拓宽酶的底物选择性，解决稀有糖核苷酸难以合成的瓶颈问题，开展对开发稀有糖核苷酸制备技术策略。.我们的课题研究分为三个方向.1. 对大肠杆菌来源的GlmU的底物识别结合结构域的保守氨基酸位点进行序列比对和结构分析，开展定点突变研究，获得了多个突变酶。酶学性质分析显示， Q76E突变酶能够合成稀有糖核苷酸CDP-GlcNAc; Y103位的突变，对GlmU的催化反应活性影响较大，Y103F突变酶活性得到显著提高，是野生酶的1.4倍。其他位点的突变研究显示，所涉及的氨基酸位点在尿苷转移酶催化反应中发挥重要的功能。GlmU突变研究工作为深入理解糖核苷酸的合成机理奠定了工作基础，为理性改造生物酶，获得目标稀有氨基糖核苷酸提供了进一步研究的思路。.2. AGX1是一个真核生物来源的糖核苷酸合成酶。我们对人源的AGX1 进行了重组表达，研究了该酶的性质，并系统地研究了它对不同核苷三磷酸的底物适应性。以该酶作为催化剂，在体外制备了两种非天然氨基糖糖核苷酸。这部分工作研究首次发现，真核生物来源的工具酶同样具有较好的底物选择广泛性，能够识别非天然底物，催化合成系列化合物。该工作拓宽了我们对真核生物酶的理解，为开发稀有糖核苷酸制备技术策略奠定了物质基础。.3.空肠弯曲菌的N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶的N-端结构域进行体外克隆和表达纯化，系统地研究了该酶的底物适应性。CjGlmU 可以催化合成16 种稀有糖核苷酸，其中对7 种稀有糖核苷酸的产率能够达到60%以上，其他的9 种也均在20%左右。基于该酶广泛的底物适应性，我们在体外成功地制备了3 种UDP-GlcNAc 的衍生物，分别是CDP-GlcNAc，UDP-GlcNBu和UDP-GlcNPr。CjGlmU 的研究工作为体外大量制备非天然糖核苷酸奠定了基础，利用该酶的催化反应，能够合成多种稀有糖核苷酸。通过对产物的分离纯化，极大丰富了糖核苷酸化合物库，为糖基转移酶的活性研究和含非天然糖残基的糖缀合物的合成研究提供了丰富的供体底物。