N-乙酰半乳糖胺代谢通路在高致病性猪链球菌中的作用及其调控机制研究

N-acetyl-galactosamine (GalNac) is the important provider of bacterial carbon source and the phosphotransferase system (PTS) is the link between bacterial carbon source metabolism and virulence. In the recent 10 years, our group has been committed to the pathogenesis of streptococcus suis type 2 (SS2) which is the severe Zoonosis, and the first to complete whole genome sequencing and functional annotation about the SS2 China's a virulent strain, but it is still unclear if SS2 is involve in PTS system of GalNac and what is a regulation network to be working. Our group further to analysis the genome of China's virulent strain 05ZYH33, and found 27 genes which is coding PTS component, then filter to an AGA gene cluster which is possible involvement in metabolism of GalNac by function prediction. In this project, we intended to identify the characteristic of GalNac PTS transcription trans-gene cluster on the basis of previous studies , compare the difference of pathogenicity between wild strains and target gene deletion mutants of SS2 by homologous recombination methods and assess the GalNac metabolic pathway molecular regulation mechanism ,which not only help to clarify SS2 GalNac metabolic pathway but also to make the molecular mechanism of SS2 highly pathogenic more clear.

N-乙酰半乳糖胺（GalNac）是细菌碳源的重要提供者，其中磷酸转移酶系统（PTS）是细菌碳源代谢与毒力相关联的纽带。课题组一直致力于重要病原菌2型猪链球菌（SS2）致病机理的研究，率先完成了SS2中国强毒株的全基因组测序及功能注释, 但尚不清楚中国高致病性SS2是否也存在参与GalNac转运的PTS系统，它又是在怎样的调控网络下发挥作用也有待深入认识。课题组前期对中国强毒株的基因组分析发现了27个编码PTS组分基因，功能预测筛选到一个可能参与GalNac的转运代谢的aga基因簇。本项目拟在前期研究基础上进一步鉴定GalNac转运基因簇PTS的转录特征，通过基因敲除的方法研究GalNac代谢通路在SS2中的作用，并利用EMSA等手段解析该通路的调控机制及效应分子。研究结果不仅有助于阐明SS2 GalNac代谢通路的分子调控机制，还将进一步深化对国内SS2高致病性的分子机理的认识。

该研究主要取得如下进展.1）利用生物信息学预测到GalNac代谢调控子分别命名为AgaR1和AgaR2，对应05ZYH33为SSU0448和SSU0447。成功构建该代谢通路可能代谢调控子SSU0447和SSU0448敲除突变株，并通过组合PCR及RT-PCR进行验证。.2）EMSA体外检测AgaR调控靶序列，通过实验证实AgaR能够与SSU0195，SSU1259，SSU0448/9，EF1809发生相互作用。并通过定量PCR证实，SSU0447（AgaR）敲除突变株相比野生株在不同生长条件下，靶蛋白的表达量有不同程度的抑制，特别是在加入GalNac后，靶蛋白的表达量有不同程度显著增多，进一步证实SSU0447确实为该代谢通路的调控抑制子。.3）RT-PCR证实突变株和野生株05ZYH33的基因调节差异：为了验证AgaR基因参与N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代谢通路，定量PCR分析敲除株和野生株中，基因相对表达量的变化。除agaS基因表达没有明显的变化，agaY基因的表达明显下调，bgaC、gadVW、gadWE和gadEF四个基因的表达发生了明显的上调，其中gadVW基因的表达上调最明显。与我们预测的一致，即SSU0448基因在该代谢通路中属于转录抑制因子。该基因的缺失，使得代谢通路部分基因的表达发生了上调，此外，RT-PCR结果证实（SSU0447）agaR可以调控其下游的部分PTS组分,实验结果提示，agaR在GalNac代谢过程中起到调控作用，并藉此参与05ZYH33的致病过程。 .4）对敲除突变株和野生株进行生物学性状比较以了解代谢调控子对代谢通路的影响，结果agaR的缺失未明显影响细菌的菌落形态、溶血活性及生长速率等生物学特性。粘附试验显示，agaR2的缺失突变会导致细菌对Hep-2细胞的粘附能力增加；抗吞噬结果显示突变株抗小鼠Raw264.7细胞吞噬的能力增加；毒力试验显示，agaR2缺失突变株对小鼠和仔猪的致病力显著降低。.5）针对2型猪链球GalNac代谢通路中 N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶基因AgaA和糖磷酸异构酶基因AgaS进行原核表达，生物信息学分析和多克隆抗体的制备以及酶活性的测定，激活剂与抑制剂的筛选，酶催化机制的推断（核心氨基酸的确定），及两酶之间相互相互关系等。