以二重特异性去磷酸化酶26为靶点的新型抗甲状腺药物的理性化筛选和先导化合物的发现

Anaplastic thyroid cancer (ATC) is one of the most lethal of all human tumors. When dual-specificity phosphatase 26 (DUSP26) was overexpressed in ATC cell lines, this protein formed a physical complex with MAPK p38 (Mitogen-activated Protein Kinase p38), and promoted survival of ATC cells by inhibiting MAPK p38-mediated apoptosis. These findings suggest that DUSP26 act as a novel amplification target for anti-ATC drug screening. In previous study, I solved crystal structure of the DUSP26 catalytic domain (61-211 residues). The structure shows DUSP26 had a distinctive C-terminal swapped structure. In this study, three-dimensional structure of DUSP26 will be determined using X-ray crystallographic study and location of the DUSP26-MAPK p38 interaction surface (anti-ATC drug target) will be performed using the pull-down assay. Based on the drug-targets located using pull-down assay or computer software assay, we will perform the virtual screening of anti-ATC drug to build a guide compound database. Then, we will re-screen the guide compounds using protein-protein interaction assay, cell toxicology assay, et al., to find several compounds lead from the guide compound database.

甲状腺未分化癌（ATC）是致死率最高的恶性肿瘤之一。二重特异性去磷酸化酶26（DUSP26）在ATC细胞里过表达后与MAPK p38 (Mitogen-activated Protein Kinase p38)形成稳定的蛋白质复合体，抑制MAPK p38使细胞凋亡的功能，导致ATC细胞的快速增生。这些发现表明DUSP26是一个抗ATC药物作用的新靶点。此前申请人测定了它的Catalytic Domain(含61-211残基)的空间结构，结果显示DUSP26具有C-端swapped的独特结构。本项研究中将测定DUSP26的空间结构和利用Pull-down定位它与MAPK p38的相互作用部位，即药物靶标。依据实测的靶标辅以计算机自动判定的靶标来开展抗ATC药物的虚拟筛选，建立候选化合物数据库。再利用蛋白质相互作用筛选、细胞毒理学筛选等复筛候选化合物，从中获得数种有成药性前景的先导化合物。

二重特异性去磷酸化酶26（Dual specificity-phosphatase 26;简称 DUSP26）是近期发现的抗肿瘤药物作用靶点，它的抑制剂是抗甲状腺未分化癌、神经胶质瘤等肿瘤新药的候选品。迄今为止用于抗肿瘤药物研究的DUSP26抑制剂仅有NSC-87877和ethy-3,4-dephostatin。为了发现活性更高的DUSP26抑制剂，本项研究基于我们测定的DUSP26催化结构域的晶体结构开展 DUSP26 新抑制剂筛选。为了构建准确的药物筛选模型，首先开展了DUSP26与底物结合机制的研究。利用同源建模法构建了DUSP26 的活性型结构，发现了可调控 DUSP26与底物结合的氨基酸残基，提出了DUSP26与底物结合过程中的酶结构变化模式。而后利用分段表达、点突变、酶促动力学方法验证了反应机制的准确性。依据DUSP26的活性型结构构建了药效团模型后利用药效团模型对接法对大型化合物数据库进行虚拟筛选，并对命中化合物进行分子对接评价，对通过评价的化合物开展酶水平活性测试，发现了4种化合物对 DUSP26具有较好的抑制活性。其中的化合物2-hydroxy-4-{6-[(5Z)-5-[(4-methylphenyl) methylidene]-4-oxo-2-sulfanylidene-1,3-th iazolidin-3-yl]hexanamido}benzoic acid（编号 H6）的抑制活性高于NSC-87877，其余 3 种与之大体相当。细胞生物学实验证明 H6 具有靶向 DUSP26 抗肿瘤细胞增殖的功能，并且活性优于 NSC-87877 和 ethy-3,4-dephostatin，是迄 今为止发现的用于成药性研究的活性最高的DUSP26抑制剂。本项研究的特色在于利用计算和实验相结合的方法正确地解析了 DUSP26与底物结合机制，基于正确的酶反应机制构建的药效团模型筛选到了具有特殊结构的高活性的 DUSP26 的抑制剂。为开展靶向抗肿瘤药物的药理学、毒理学等研究奠定基础。此外，我们在抗肿瘤中药材厚鳞柯和流苏金石斛体发现了和H6结构相似的天然 DUSP26 抑制剂。为开展中药抗肿瘤的药效物质基础和作用机制以及资源利用等研究找到了新的切入点，建立了生物学基础研究和中药资源产业开发的新桥梁。