抗黄曲霉毒素 B1 鼠源单域抗体定向驼源化改造及其结合活性机制研究

The variable domain of heavy chain antibody from the family of Camelidae (Nanobody or VHH), as a entire binding antigen fragment, is a promising reagent in the development of immunoassays. However, due to the preference of immunized animals and antigens, there is no guarantee of obaining the antibody with high affinity. In this work we plan to isolate an antibody binding with Aflatoxin B1 (AFB1) on the basis of its sequence without immunization. According to the identities between mouse-derived single domain antibody (VH) and VHH，VH is mutant in site-directed on FR2 and randomized in CDR to construct a synthetic library. Based on computational design, site-directed mutations are carried out to get high affinity camelized VH with AFB1. The camelized VH (cVH) binding activity with AFB1 and its binding site are estimated based on the charateristics and structure changes. This study may provide a potentially useful approach to produce antibody against small molecules, and may make it possible for engineering recombined proteins defined by their sequences.

驼科纳米抗体 (VHH) 是一类保留了完整抗原结合活性的单域抗体，是免疫方法测定小分子类物质的重要工具之一。但是，受到免疫动物和试剂等因素的影响，高亲和性VHH存在制备难度大、成本高等缺陷。本研究以黄曲霉毒素B1 (AFB1) 为例，旨在不依赖动物免疫、对抗体基因序列驼源化改造以表达出抗AFB1高亲和力抗体。以抗AFB1鼠源单域抗体 (VH) 为模板，借助其与VHH的同源性，通过FR2结构域定点突变和CDR结构域随机化建立库容大而丰富的抗体合成文库；结合计算机模拟对特定位点突变，实现鼠源VH的定向驼源化改造，获得抗AFB1的高亲和力驼源化抗体 (cVH)。评价cVH与AFB1的结合活性，分析其结合位点及关键氨基酸的变化，揭示其结合活性机制。本研究可为获得精确识别AFB1类小分子物质高亲和力抗体提供夯实的理论基础，也可为基于抗体序列制备特定功能抗体提供有效的技术支撑。

黄曲霉毒素B1主要是由黄曲霉、寄生曲霉产生的次级代谢产物。驼源单域重链抗体VHH是一类分子量小、易于操作的抗原结合单位。但是，其制备成本相对较高，直接影响其应用。本项目以黄曲霉毒素B1为研究对象，借助驼源VHH与鼠源单域重链抗体VH的同源性，通过体外定向改造VH,实现鼠源VH的定向驼源化。本项目以小分子黄曲霉毒素B1为研究对象，在比对数据库中鼠源VH和驼源VHH的序列的基础上，定点突变了鼠源VH框架区FR2的V37F、R44E、L45R、W47G以及FR4上的W103R，并采用抗黄曲霉毒素B1驼源VHH的CDR3高变区。结果表明FR结构域上的特异性位点显著影响了驼源化VH的可溶性表达，通过优化采用酵母表达系统得到胞内上清表达的抗体，通过活性鉴定，得到其与AFB1的结合能力较鼠源VH显著提高;同时，通过从天然驼源VHH文库中筛选与AFB1特异性结合的VHH2,通过定点突变，CDR3置换以及CDR3随机化等处理，结合同源建模和分子对接等手段，表明CDR3高变区与AFB1之间氢键作用力会显著影响两者的结合能力，且位于CDR3高变区的125-136位氨基酸所形成的loop结构可以特异性结合AFB1,提高其与AFB1的亲和力。本项目的研究结果为小分子物质特异性鼠源VH定向驼源化提供研究基础，也为单域重链抗体的体外亲和力成熟提供理论支撑。