抗黄曲霉毒素B1高亲和力抗体的分子机理研究及改造

The acquirement of antibody is the main emphasis in the research of immune detecting technology for small molecular contaminan. The development of genetic engineering antibody provides new approach for the preparation of antibody. However, the current study have found that genetic engineering antibodies ordinarily exist lower affinity, and testing effect can not catch up with that of intact antibody. . In this project, with aflatoxin B1 as the research project, anit AFB1 McAbs of different sensitivity and specificity will be used to clone gene of single chain variable fragment and express anti AFB1 single chain variable fragment(ScFv). The effect of gene level, amino acid composition and antigen antibody complex spatial structure characteristics on antibody affinity, specificity and sensitivity will be analyzed by the methods of homology modeling, molecular docking and single crystal X-ray diffraction to reveal the molecular mechanism of its affinity forming in the process of different single chain variable fragments, monoclonal antibodies and AFB1 interactions. On this basis, the key gene site of anti AFB1 ScFv gene will be transformated, and imported into eukaryotic cell expression system or hybridoma cell by cell transfection or gene transfer techniques, and then obtain high affinity intact antibody against AFB1 by screening and analysis. So, the establishment of high affinity antibody method will be discussed. The study will provide critical theory guide for the establishment of high affinity antibody preparation techniques for AFB1 and other small molecule antigen, and also provides a new strategy for antibody molecule modification.

在小分子污染物的免疫检测技术中，抗体的获得一直是研究的重点。基因工程抗体的研发，为抗体的制备提供了新途径，但基因工程抗体普遍存在亲和力较低、小分子抗体用于免疫检测的效果不及完整抗体。本项目拟以黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1, AFB1）为研究对象，以前期获得的抗AFB1单克隆子为材料，克隆表达抗AFB1单链抗体(ScFv)，综合运用同源模建、分子对接和X-射线衍射技术，分析不同ScFv、McAb与AFB1相互作用时，其基因水平、氨基酸水平和抗原抗体复合物空间结构对抗体亲和力、灵敏度和特异性的影响，揭示其亲和力形成的分子机理。在此基础上采用基因突变技术，对抗AFB1ScFv关键基因位点进行改造，然后将其导入真核细胞表达系统或杂交瘤细胞，筛选高亲和力的抗AFB1完整抗体，探讨建立高亲和力抗体的新方法。为AFB1等小分子抗原高亲和力抗体制备提供关键理论指导，也为抗体分子改造提供新策略。

在小分子环境污染物的免疫检测技术研究中，抗体试剂的获得一直是人们研究的重点。基因工程抗体的发展，为抗体的制备提供了新的途径和思路，但研究发现，基因工程抗体普通存在亲和力较低，小分子抗体用于免疫检测时效果不及完整抗体等不足。本项目以黄曲霉毒素B1为研究对象，以不同灵敏度、特异性的抗AFB1单克隆子为材料，克隆其单链抗体（ScFv）基因，制备单链抗体，比较不同表达系统表达ScFv的差别。综合运用同源模建、分子对接等方法，分析单链抗体与AFB1相互作用时其基因水平、氨基酸水平上的差异对抗体亲和力、特异性和灵敏度的影响。采用定点突变的方法对预测的关键氨基酸位点进行突变，对突变前后抗体的性质进行分析。结果表明，ScFv在不同表达系统（E. coli BL21(DE3)，CHO细胞，昆虫Sf9细胞和毕赤酵母GS115）中的表达量，生物活性，稳定性和表达成本上均有差异，应根据产物的结构特点和最终用途选用合适的表达系统。当构建不同VH/VL顺序的scFvs抗体基因并在E. coli BL21(DE3)中表达时，两条scFvs均可成功表达，但主要以无活性包涵体的形式存在，且两者产量基本一致，经过蛋白质复性，仅scFv2E6VH-linker-2E6VL表现出生物活性。将同源模型ScFv-2C10与AFB1进行分子对接，发现ScFv-2C10中氨基酸残基Arg-67、Asn-87和Lys-237与AFB1形成了氢键，根据其CDR和FR区划分，选择Arg-67、Asn-87、Lys-237以及重链和轻链CDR3区的极性氨基酸作为下一步研究的关键氨基酸，采用定点突变方法进行单点突变，将这些极性氨基酸突变为与其结构相似的非极性氨基酸，成功获得14个突变体。将原始菌株及突变体均转入E. coli BL21(DE3)感受态细胞中进行目的蛋白的诱导表达，分析发现突变体R67L的亲和常数较原始株提高约3倍，灵敏度较原始株提高约1倍。以AFB1为研究对象，从AFB1-BSA免疫小鼠的脾细胞内扩增ScFv基因，将ScFv片段插入pCANTAB5e载体中，应用噬菌体展示技术筛选抗AFB1-ScFv，并对其性质进行分析，探讨了采用噬菌体展示技术获得高亲和力抗体的方法。本研究结果为建立AFB1类小分子抗原高亲和力抗体制备技术提供了一定的理论指导，也为抗体分子的改造提供了新的策略。