柑橘大实蝇蛹期滞育的分子机理研究

Chinese citrus fly, Bactrocera (Tetradacus) minax (Enderlein), is a devastating citrus pest. The outbreaks of it in China have caused large economic losses, thus arousing increasing attentions. The obligatory diapause occurring in pupal stage plays an important role in coordinating the relationships between the pest and the environment. Therefore, study on the mechanisms underlying the diapause is conducive to understand how the diapause coordinates pest-environment relationships. Also, it contributes to artificial termination and regulation of diapause, thereby solving the problems in rearing of this pest in the laboratory and providing new thoughts in pest management. So far,the molecular mechanisms underlying diapause, however, remains unkown. So, this study will start by long-term monitoring the concentrations of carbon dioxide produced by respiration in order to fit the metabolic rate curve of whole pupal stage, based on which the entry and termination of diapause can be determined. Then, samples at pre-, early, middle, late, and post-diapause stages will be compared in terms of digital gene expression and metabolic profiling to find out the specific or significantly different gene expressions and metabolite levels. Several most important genes will subsequently be screened to investigate the function of their encoding protein in vivo through RNAi technique. At last, the results of all these approaches will be comprehensively analyzed to reveal the mechanisms underlying the pupal diapause of Chinese citrus fly.

柑橘大实蝇是一种危害严重的柑橘害虫，近年来在我国多地暴发成灾，造成大量经济损失，因此受到人们广泛重视。该虫于蛹期出现专性滞育，对协调其与环境的关系具有重要的作用。研究滞育机理不仅有助于了解其如何协调与环境之间的相互关系，还能在此基础上人为解除或调控滞育，帮助解决其实验室内饲养技术的难题，也能为其综合防治提供新思路。然而，目前尚未对滞育的分子机理展开相关研究。因此，本项首先采用长期监测呼吸产生二氧化碳浓度的方法，计算拟合整个蛹期的代谢速率曲线，从而判断滞育的发生与结束。随后，在其基础上比较分析滞育准备期、滞育早、中、晚期以及滞育结束后发育期5个时间点上样品的数字基因表达谱与代谢谱差异，找出各时间点上具有特异性或显著差异的基因表达与代谢产物水平，随后利用RNAi技术对相关重要基因进行沉默等手段验证基因编码蛋白的功能。最后综合分析各研究手段的结果，达到揭示柑橘大实蝇滞育机理的目的。

柑橘大实蝇 Bactrocera (Tetradacus) minax (Enderlein) 是柑橘类水果的重要害虫之一。该虫在长达半年的蛹期中发生专性滞育，给实验室饲养以及后续研究带来了诸多阻碍。本课题旨在明确柑橘大实蝇滞育发生与解除的分子机理，研究结果有助于了解该虫如何协调与环境之间的相互关系，有助于发掘人为解除或调控滞育的手段，也能为其综合防治提供新思路。首先，通过自主设计的便携式二氧化碳检测仪对柑橘大实蝇整个蛹期的呼吸速率进行测定，拟合了蛹期呼吸速率曲线。根据该曲线确定了五个采样时期，即滞育准备期（PreD）、滞育早（ED）、中（MD）、后（LD）期以及滞育结束后发育期（PD）。随后利用高通量测序技术对这五个点收集的蛹样本进行表达谱测序。在十对两两比对的表达谱中，总共有 4,808 条基因显著上调或下调，这些基因主要与新陈代谢、信号转导、内分泌系统和消化系统有关。利用 qPCR 技术对表达谱的准确性进行了验证，结果表明随机挑选基因的 qPCR 检测结果与数字基因表达谱测序结果呈现高度的相关性，说明柑橘大实蝇不同蛹期数字基因表达谱测序结果可信。此外，主成分分析表明处于滞育维持期的样本相互之间差异不大，而与其它两个时间点的样品差异较大。然后利用核磁共振波谱分析检测五个时间点上柑橘大实蝇体内的代谢物质的种类及其含量。共检测到49个代谢物，去除不能准备定量的瓜氨酸，剩余48种用于后续统计分析。主成分分析及最小二乘判别分别都表明滞育期间的三个时间点样品与其他两个时间点样品代谢组差异显著，这与基因表达谱的结论相一致。变量重要性投影值计算结果表明，共9种代谢物对组间差异有显著贡献，尤其是脯氨酸与海藻糖。这两种物质都有保护细胞抵御外界不良环境胁迫的作用，可能在柑橘大实蝇滞育过程中赋予个体更高的耐寒性，从而成功越冬。最后从转录组数据中找到了编码海藻糖合成途径中的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，利用RNAi技术证实了该基因在海藻糖合成、几丁质合成以及变态发育中的重要作用。本课题研究成果为后续深入而全面解析分子机理奠定了基础。