黄曲霉毒素分子工程抗体活性机制研究

研究小分子污染物抗体规模化制备技术是推动免疫分析技术被广泛应用的重要前提和支撑，也是该领域创新源头。前期研究黄曲霉毒素抗体规模化制备技术与调研后发现了一个共性问题，即小分子基因工程抗体活性很不稳定，然而，目前其活性机制不明。因此，本项目拟以强致癌性黄曲霉毒素为突破口，在已制备成功1C11等共23种阳性单克隆杂交瘤细胞株（对应抗体ELISA的IC50值范围为0.001-32.6 ng/mL，克隆并测定了其中9株抗体可变区基因）作为研究材料的基础上，研究抗体一级结构差异与抗体活性差异之间的关联性；再构建随机单链化"阳性抗体库"，通过噬菌体等展示技术筛选分子工程抗体，研究抗体重组前、后结构（包括一级结构和空间结构等）差异与活性差异之间的关联性，探索工程抗体活性差异的分子基础，探明针对小分子的工程抗体活性机制，为研究建立黄曲霉毒素等小分子污染物低成本、活性稳定的抗体规模化制备技术提供关键理论指导。

研究小分子污染物抗体规模化制备技术是推动免疫分析技术广泛应用的重要前提。前期研究黄曲霉毒素抗体规模化制备发现一个共性问题，即小分子基因工程抗体活性很不稳定，然而其活性差异的分子机制至今不明。因此本项目以强致癌性黄曲霉毒素为突破口，在已制备成功1C11等23种单克隆杂交瘤细胞株为研究材料的基础上，克隆出不同黄曲霉毒素单克隆抗体可变区基因并进行多序列比对（共完成15株），比较重组前抗体一级结构与抗体活性差异之间的关联性，结果显示与灵敏度最高的抗体1C11（IC50值为0.001ng/mL）序列同源性较高的单克隆抗体，其灵敏度与1C11差异较小；而与1C11同源性较低（50%左右）的单克隆抗体，其灵敏度与1C11差异较大。这一结论显示抗体一级结构决定抗体对抗原识别能力大小。利用15个不同黄曲霉毒素单抗轻、重链可变区基因片段，通过连接肽进行随机组合单链化，成功构建库容量为3.5×105，多样性好的黄曲霉毒素噬菌体展示阳性抗体库。通过噬菌体展示筛选得到两株对黄曲霉毒素有特异性且亲和力较高的单链抗体1A7和2G7。其中2G7是目前国内外报道的灵敏度最好的黄曲霉毒素单链抗体（IC50值为0.01ng/mL）。所有克隆得到的单抗可变区序列比对分析，选取七株同源性较高但灵敏度差异明显的通用抗体组抗体可变区序列作为研究对象，采用软件MODELLER对抗体可变区进行同源模建，将所得模型与小分子半抗原AFB1利用Autodock Vina软件进行分子对接，对不同黄曲霉毒素抗体分子对接模型的比较寻找对抗体超高灵敏度识别起关键作用的氨基酸。对接模型中抗体抗原结合作用力的比较分析发现，黄曲霉毒素单克隆抗体与AFB1小分子半抗原之间的作用力主要是氢键、疏水作用与π-π共轭作用；抗体重链上H49位的丝氨酸与H103位的苯丙氨酸为灵敏度最高的单抗1C11特有，可能是对其超高灵敏度形成起关键作用的氨基酸。为了验证这一推论，采用定点突变的方法将灵敏度较差、相应位点不是这两个氨基酸的抗体进行定点突变，发现突变后抗体灵敏度确有提高，尤其是同时具备两个关键氨基酸的双突变体，灵敏度较之野生型都提高了近20倍。实验结果与理论推测相符，证明所预测的H49位丝氨酸与H103位苯丙氨酸确实对黄曲霉毒素抗体抗原高灵敏度识别起关键作用，由此也揭示黄曲霉毒素抗体超灵敏识别的分子机制，为分子生物学技术对抗体灵敏度改造提供理论依据