人退变软骨终板干细胞转录后修饰水平的分化调控及机制研究

The pathogenesis and treatment of intervertebral disc degenerative diseases are closely related to composition and properties of chondrocytes in intervertebral disc cartilage endplate. Our previous study found that there were stem cells in degenerated intervertebral disc cartilage endplate(DCESCs), and their osteogenic/chondrogenic differentiation potential was stronger than mesenchymal stem cells from the same source. Alternative splicing is an important process of post-transcriptional modification, and plays key roles in physiological regulation of stem cells. This study will focus on the regulation of osteogenic/chondrogenic differentiation of DCESCs, and splicing events will be detected by exon array before and after osteogenic/chondrogenic differentiation. Results of exon array are to be verified and further analyzed by GO analysis. Alternative splicing of insulin receptor (IR) will be used as a model to study the mechanisms of DCESCs differentiation regulated by alternative splicing. Expression and function of IR splicing variants IR-A/B and mechanisms of IR alternative splicing during DCESC osteogenic/chondrogenic differentiation will be illustrated using techniques of molecular biology of gene and proteins. Results of this research will elucidate mechanisms of post-transcriptional modification of chondrogenic and osteogenic differentiation of DCESCs. In addition, this study will provide new theoretical insight for the target-directed treatment and prevention of degenerative disc diseases.

椎间盘退行性病变发病机制及治疗的研究与终板内软骨细胞的组成和特性密切相关。本课题组前期研究发现人退变椎间盘软骨终板内存在干细胞（DCESCs），并且其成骨/软骨分化性能显著高于同来源的间充质干细胞。可变剪接是转录后修饰的一个重要过程,在干细胞生理调控方面有关键的作用。本研究拟以DCESCs作为研究对象，对其进行成骨/软骨的诱导分化，并对分化后的成骨/软骨细胞进行鉴定，用外显子芯片技术分析DCESCs向骨/软骨诱导分化前后发生变化的可变剪接事件，对获取的可变剪接变异体进行GO分析和验证。可变剪接对DCESCs分化调控机制研究以胰岛素受体(IR)可变剪接为模型，拟应用基因、蛋白水平等检测手段分析IR剪接变异体（IR-A/-B）在调控分化方面的功能，以及DCESCs成骨/软骨分化过程中IR不同剪接变异体表达的调控机制。本研究所取得的成果将DCESCs成骨/软骨分化调控研究引入到转录后修饰的水平。

椎间盘退行性病变发病机制及治疗的研究与终板内软骨细胞的组成和特性密切相关。本课题组自获得国家自然基金资助后，课题负责人按照预定方案进行组织人员安排及分工，课题成员认真按照国家自然基金青年项目任务书实施。 通过近三年的实验研究，我们发现发现人退变椎间盘软骨终板内存在干细胞（DCESCs），其成骨/软骨分化性能显著高于同来源的间充质干细胞。可变剪接是转录后修饰的一个重要过程,在干细胞生理调控方面有关键的作用。本研究以DCESCs作为研究对象，对其进行成骨/软骨的诱导分化，并对分化后的成骨/软骨细胞进行鉴定，用HTA2.0芯片分析DCESCs向骨/软骨诱导分化前后发生变化的可变剪接事件，对获取的可变剪接变异体进行GO分析和验证。同时，用HTA2.0芯片补充研究了在生理低氧和常氧条件下，DCESCs可变剪接事件，以及DCESCs向骨/软骨诱导分化前后发生变化的可变剪接事件，并对这些可变剪接事件进行生物信息学的分析。在常氧、常氧+ DMOG (HIF1A诱导剂模拟“化学低氧”)、低氧和低氧+YC1（HIF1A抑制剂模拟“化学常氧”）4种条件下成骨诱导及成软骨诱导DCESCs, 研究HIF1A对低氧条件下人退变椎间盘软骨终板干细胞（DCESCs）分化调控作用机制及对MIF表达的影响。用MIF-overexpression慢病毒载体将表达量本来较低的MIF过表达；而在低氧及化学低氧状态下，用MIF-shRNA慢病毒载体将表达量本来较高的MIF下调。研究MIF在HIF1A调控人退变椎间盘软骨终板干细胞（DCESCs）成骨及成软骨分化这一过程中的作用机制。MIF通过进入细胞核以转录因子的作用方式对低氧条件下人退变椎间盘软骨终板干细胞（DCESCs）分化调控作用机制研究。本研究所取得的成果将DCESCs成骨/软骨分化调控研究引入到转录后修饰的水平。