钙离子调控TRPM2激活门控的分子机制

As second messager, Ca2+ mediates many important signaling pathways. It is well known that TRPM2 as a ROS sensor is strictly regulated by intracellular and extracellular Ca2+. Recently, one study reported Ca2+ activated TRRM2 channel by CaM binding to IQ like motif of N terminus. However, some studies including our study have indicated Ca2+ directly activated TRPM2, suggesting this issue is still debatable. We predicted the potential EF-loops motif in N terminus of TRPM2, our preliminary data showed several mutations of conserved residues significantly reduced TRPM2 activity. In addition, recent study has presented the structure of TRPM4 binding with Ca2+, accordingly, we found these binding sites are also conserved in TRPM2. In this study, by combining simulation modeling, mutagenesis, electrophysiology, protein purification and patch fluorometry techniques, we hope to elaborate the mechanism of Ca2+ activated TRPM2 gating process, and uncover the dynamic process of TRPM2 activation by Ca2+ and ADPR, which will shed the new light on the mechanisms of TRPM2 mediated physiological and pathological processes in future.

钙离子（Ca2+）作为生物体的第二信使，介导了细胞内许多重要信号级联反应。已有的研究表明TRPM2通道作为一种氧化应激的感受器，其门控受到细胞内外钙离子严格调控。近期有研究报道Ca2+通过CaM结合到TRPM2的N末端激活TRPM2通道，但申请人和其它研究组发现Ca2+能够直接激活TRPM2通道，提示其作用机制仍存争议。申请人发现TRPM2的N末端存在潜在EF-loop基序，功能检测显示几个保守位点突变显著削弱通道功能。此外，最近研究展示了TRPM4结合Ca2+的结构，申请人序列比对发现TRPM2跨膜区也存在该Ca2+结合位点。为此，本项目拟组合同源模建，分子突变，电生理记录，蛋白纯化和亲和分析，荧光电生理联用技术等手段，阐明Ca2+激活TRPM2通道的分子机制，并揭示Ca2+与ADPR协同激活TRPM2的动态过程，为理解TRPM2介导各种生理病理功能的分子机制提供重要的实验依据。

TRPM2通道属于瞬时受体电位超家族M亚家族，是一种Ca2+通透的非选择性阳离子通道。其作为一种ROS感受器，已被报道介导神经退行性疾病、脑卒中、糖尿病等氧化应激相关疾病。Ca2+作为生物体的第二信使，介导了细胞内许多重要信号级联反应。研究报道，Ca2+不仅可与ADPR协同激活TRPM2通道，还可单独直接激活通道，但其具体作用机制尚不清楚。因此，本项目针对Ca2+激活TRPM2通道的分子机制展开研究。首先，我们引入计算生物学对TRPM2通道N端预测的结构域及跨膜区进行同源模建。我们在人源TRPM2通道的N端发现了两端潜在的EF-loop基序，在S2-S3跨膜区域发现一个潜在的钙离子结合位点。针对预测位点，我们使用点突变、细胞电生理技术系统探究了这些位点对TRPM2通道激活及失活的影响。结果表明，D267-D278基序可作为一段EF-loop基序，参与Ca2+对TRPM2通道的激活调控，同时明确跨膜区S2-S3连接区处的确存在Ca2+结合位点调控TRPM2激活。其次，我们使用荧光电生理联用技术发现ADPR与通道结合后，Ca2+不会进一步的引起胞内区构象的变化。此外，我们还使用冷冻电镜解析了全长人源TRPM2的蛋白结构，结合系统进化树的分析，发现在进化过程中钙离子的调控是一个由简单到复杂的过程。综上所述，本项目工作不仅在TRPM2通道N端鉴定出一个新型的对Ca2+激活TRPM2通道非常关键的EF-loop基序，也揭示了Ca2+与通道S2-S3domain结合对通道激活及失活过程的影响，为Ca2+调控TRPM2通道门控过程提出了新机制。以上的研究表明Ca2+调节TRPM2通道的门控过程十分精细复杂，为离子通道门控机制研究提供了新的范式。同时也有助于更好的理解人源TRPM2通道的不同生理病理功能，也为以TRPM2通道为靶点的药物研发提供新的分子基础。