短暂性脑缺血复灌后TRPM2介导自噬抑制引发神经元死亡的作用机制

Autophagy is a cellular preserved process which is responsible for degrading biological macromolecules and cell organelles through lysosome. Recently, accumulating studies have indicated autophagy played a critical role in brain ischemia injury, but its mechanism is still debated. Although applicant and other people's study have previously reported that transient receptor potential melastatin 2（TRPM2） channel activated by reactive oxygen species (ROS) is required for brain ischemia reperfusion injury induced neuronal death, the mechanism is largely unknown. Our unpublished data have indicated that TRPM2 knockout mice dramatically reduced neuronal death induced by transient ischemia reperfusion injury, and interestingly, our data firstly showed largely decreased expression of p62 and TOMM20 in TRPM2 knockout mice compared with that of wild type mice, suggesting that TRPM2 was involved in the inhibition of autophagy which resulted in neuronal death. Therefore, by combining flurorescent imaging, pharmacology, biochemistry and electron microscopy techniques, we hope to elaborate the mechanism of TRPM2 inhibited autophagy in ischemia induced neuronal death in vivo and in vitro, which will find a new function of autophagy regulating brain ischemia reperfusion injury and identify a potential therapeutic target in future.

细胞自噬是一种细胞利用自身溶酶体途径降解生物大分子和细胞器的过程。近年来的研究显示自噬在脑缺血损伤过程中扮演了十分重要的角色，但其作用机制仍然存在许多争议。探究自噬在脑缺血中的作用是近年来自噬研究的一个热点。申请人和其它研究组的研究报道已经发现氧化应激激活的TRPM2通道介导了脑缺血损伤引发的神经元死亡，但其作用机制仍不清楚。最近，申请人前期研究显示在短暂局灶性脑缺血复灌后，TRPM2 敲除小鼠能显著减轻神经元死亡，生化检测显示其自噬蛋白p62和线粒体的TOMM20表达显著下降，提示TRPM2可能通过抑制自噬功能介导了神经元死亡。为此，本项目拟用TRPM2基因敲除小鼠，组合荧光成像、药理学，生化和电镜等实验手段，从在体和离体研究TRPM2对自噬功能的调控机制，阐明脑缺血复灌过程中TRPM2抑制自噬功能导致神经元死亡的作用机制，为揭示自噬在脑缺血疾病中的作用提供新的实验依据和潜在治疗靶点。

线粒体功能损伤是缺血性脑卒中引起神经损伤的一个重要特点，线粒体受损引起线粒体活性氧产生，随后激活线粒体自噬，从而修复受损线粒体，减轻线粒体活性氧产生。然而，作为一个活性氧敏感的非选择性阳离子通道，TRPM2 离子通道在其中是否起作用以及如何起作用还不甚清楚。因此，这个项目针对 TRPM2 通道在缺血再灌注引起线粒体自噬中的功能及机制展开研究。首先我们发现，敲除 TRPM2 能够显著降低缺血造模引起的神经功能评分及梗死面积。其次我们的研究发现，缺氧缺糖处理野生型原代神经元后，线粒体自噬上调，在 TRPM2 通道特异敲除的原代神经元上，线粒体自噬水平进一步升高。进一步研究发现，缺糖缺氧处理原代神经元后，引起 TRPM2 依赖的钙离子内流，从而激活钙离子依赖的钙调蛋白激酶 CAMKII。激活的 CAMKII 能够转位到受损线粒体上，通过与 E3 泛素化连接酶 Parkin 互作，从而抑制 parkin 转位到受损的线粒体上启动线粒体自噬。最后，我们检测了神经元线粒体能量代谢及细胞凋亡蛋白，结果证明敲除 TRPM2，降低细胞内钙离子或者抑制 CAMKII 活性显著修复了线粒体能量代谢，从而减轻了缺糖缺氧引起的细胞凋亡。我们的研究首次证明 TRPM2 通道通过调控钙/钙调蛋白激酶 CAMKII,进而抑制 parkin 转位到线粒体从而影响线粒体自噬，提示TRPM2 通道是脑卒中的药物干预的新靶点。