植物电压门控钾离子通道AKT1的分子机制

As the most abundant cation in a living plant cell, potassium is central to the fundamental processes of growth, development, maintenance of osmotic pressure, and stress responses. The potassium concentration in soil is relatively low and fluctuating. Several families of ion channels are in charge of potassium uptake from the soil solution and subsequent transport within the plant. AKT1 is such a potassium channel which belongs to the Shaker-like voltage-gated potassium channels. It has a high affinity to potassium and is regulated by phosphorylation. AKT1 plays an important role in hypoosmolality response and potassium uptake in stress environments. Structure information of plant potassium channel is still largely unknown, which limits our knowledge about the potassium transport mechanism. In this project, we plan to work on AKT1 protein in Arabidopsis using structural and biochemical analysis, trying to solve its high resolution structure and reveal the molecular mechanism of ion selectivity, gating, voltage sensing and phosphorylation regulation. This will help us to deeply understand the function and mechanism of potassium channels.

钾离子是植物细胞中最重要的营养元素之一，在生长发育、渗透压维持和逆境耐受等过程中发挥重要作用。土壤中钾离子浓度相对较低且不稳定，植物依赖于膜上钾离子运输蛋白来吸收和传递钾离子。AKT1蛋白是植物Shaker类电压门控钾离子通道家族中重要的成员，对钾离子具有高亲和力，运输过程受到磷酸化的调控，在植物抵御低渗压力、低钾环境中钾离子的吸收和抵抗逆境胁迫等过程中起着关键作用。目前我们对植物钾离子通道蛋白的研究存在很大缺失，一些关键的钾离子通道蛋白仍缺少详细的三维结构信息，极大地限制了对植物运输钾离子分子机制的理解。本项目拟对植物AKT1蛋白开展结构和功能探索，解析AKT1高分辨率三维结构，研究其动态构象变化过程，阐示其离子选择性、电压感受、门控以及受磷酸化调控的分子机理，为深入理解钾离子通道的功能提供帮助。

作为植物最重要的营养元素之一，钾离子在植物生长发育、渗透压维持和逆境耐受等过程中发挥关键作用。AKT1蛋白是植物Shaker类电压门控钾离子通道家族中的重要成员，对钾离子具有高亲和力，在细胞膜超极化状态下激活，并且其通道活性受到磷酸化的调控。研究发现AKT1蛋白在植物抵御低渗压力、低钾环境中钾离子的吸收和抵抗逆境胁迫等过程中发挥了关键作用。本项目针对模式植物拟南芥中的AKT1蛋白开展了系统的结构和功能研究。我们在哺乳动物悬浮培养细胞系HEK293F中，成功表达纯化了AKT1蛋白，并利用冷冻电镜单颗粒重构技术，解析了AKTI野生型全长蛋白分辨率为3.2 Å的高分辨率三维结构。同时，我们搭建了基于HEK293T细胞的AKT1通道电流检测体系，利用膜片钳技术对AKT1的通道激活和受磷酸化调控过程进行了细致分析，验证了AKT1受CBL1和CIPK23磷酸化激活的调控过程。基于此系统，我们对结构中观察到的可能影响通道激活的关键氨基酸位点进行了分析，验证了这些氨基酸的功能。同时利用质谱手段对野生型全长AKT1单独转染提纯的蛋白，以及与激酶CBL1和CIPK23共转的AKT1蛋白进行分析，鉴定了六个磷酸化位点。通过对AKT1蛋白不同截短突变体的分析，我们最终发现T750这一位点对于AKT1通道磷酸化激活和活性调控具有关键作用。这些研究成果揭示了AKT1蛋白的结构和受磷酸化调控的分子机制，极大丰富了我们对于植物钾离子通道的认识，为理解植物营养吸收和环境响应提供了重要帮助。