诱导系统骨髓间充质干细胞归巢治疗牙周组织缺损的效果及其机制

The aim of this study is to evaluate the role and mechanism of amelogenin in the treatment of periodental defects by inducing systemical bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSCs)' homing. Based on the latest progress about the role of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the maintenance and regeneration of periodental tissue and our preliminary data suggesting that AML promotes the migration of BMMSCs, our proposed experiments will 1)use the chamber system to demonstrate that AML promotes the migration of BMMSCs by activing Wnt/β-catenin pathway.2)use the GFP＋ bone marrow chimeric combined with periodental defects mice model to observe the role of AML and Wnt3a,the small molecule substitute, in inducing BMMSCs'homing to the periodental tissue and promoting the periodental regeneration.3)study the feasibility of using Wnt3a for periodental regeneration.The study on promoting periodental regeneration by enhancing systemical BMMSCs'homing has not been reported. Our findings will provide new strategy for the study of periodental regeneration,new medicine for the treatment of periodental defects, new theoretical and technical basis for periodental regeneration around implants,as well as tooth regeneration.

本项目旨在研究釉原蛋白（AML）诱导系统骨髓间充质干细胞（BMMSCs）归巢在牙周组织缺损治疗中的作用及其机制。基于国际上对系统骨髓干细胞在牙周组织代谢平衡中所起作用研究的最新进展，以及本项目组前期对AML促进BMMSCs迁移的研究结果，本项目拟证实AML通过Wnt/β-catenin信号通路促进其迁移，并采用绿色荧光蛋白小鼠骨髓移植结合急性牙周缺损模型,观察AML及β-catenin激动剂Wnt3a作为AML的小分子替代物在诱导BMMSCs向牙周组织归巢并参与牙周组织再生过程中的作用。在此基础上，进一步探讨将Wnt3a应用于牙周缺损治疗的可行性。目前国内外从诱导系统BMMSCs归巢的角度促进牙周再生的研究还未见报道。本项目的研究结果可为牙周再生研究提供新的思路，为牙周组织缺损的临床治疗提供新的药物和方法，也可为种植义齿种植体周围的牙周再生以及牙齿再生研究提供理论和技术依据。

牙周病是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类口腔和全身健康的主要口腔疾病，因此牙周炎的防治越来越引起学者们的重视。牙周病研究的热点之一是通过组织工程的方法，促使牙周组织再生。目前的牙周组织再生研究大都基于干细胞移植策略，即先将种子细胞提取出体外，培养和扩增后，再种植于适合的支架材料上，然后将其植入牙周缺损部位进行牙周再生。但干细胞移植也面临费用昂贵、风险较高及技术复杂等问题。结合牙周组织的特点，从技术和经济角度考虑，促进干细胞归巢从而促进牙周再生更为适用。 .本课题旨在研究釉原蛋白（AML）诱导系统骨髓间充质干细胞（BMMSCs）归巢在牙周再生中的作用及其机制。基于国际上系统骨髓干细胞在牙周组织代谢平衡与再生中作用研究的最新进展，以及本课题组前期对AML促进BMMSCs迁移的研究结果，本课题拟证实AML通过Wnt/β-catenin信号通路促进其迁移。目前完成了重组小鼠釉原蛋白（rAm）的构建、纯化，对小鼠骨髓间充质干细胞进行了分离、培养，用BMMSCs检测rAm的生物学活性，发现成骨和成胶原相关基因Colα1、ALP、Runx2、Osteocalcin随着釉原蛋白浓度的升高，其表达量呈上调趋势，证明了获得的釉原蛋白具有生物活性。用Transwell法观察rAm对BMMSCs定向迁移的影响，再用β-catenin通路特异性阻断剂DKK-1观察其对重组釉原蛋白促进BMMSCs迁移的影响。结果发现20，50，100ng/ml的重组釉原蛋白对P3代骨髓间充质干细胞有促迁移作用，随着浓度的升高，迁移能力增加，差异有统计学意义（P<0.05）。根据实验结果选取促进细胞迁移的最佳重组釉原蛋白浓度100ng/ml，用β-catenin通路特异性阻断剂DKK-1观察其对重组釉原蛋白促进BMMSCs迁移的影响，结果显示DKK-1组明显抑制了BMMSCs的迁移，差异有统计学意义（P<0.05）。说明重组釉原蛋白促进骨髓间充质干细胞迁移，部分是通过用β-catenin通路进行的。观察AML及DKK-1对β-catenin的影响后发现AML可显著上调β-catenin的表达，DKK-1可阻断这种上调作用。.接下来将采用绿色荧光蛋白小鼠骨髓移植结合急性牙周缺损模型,观察AML及β-catenin小分子激动剂Wnt3a在诱导BMMSCs向牙周组织归巢并参与牙周组织再生过程中的作用。在