激活式核酸适配体荧光探针示踪骨髓间充质干细胞向骨缺损处归巢的研究

In order to track the migration of mesenchymal stem cell (MSC) in vivo for the purposes of regenerative medicine studies, the cells are routinely labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticle (SPION) and then monitored via magnetic resonance imaging (MRI). This strategy is marred by the occurrence of false positive signals and uncertainty of MSC viability. In order to solve these problems, an aptamer specifically recognizing MSC would be screened out via SELEX method, based on which an activable aptamer fluorescence probe (AAP) would be developed for the detection of viable MSCs in vivo. Furthermore, a dual-modality MSC tracking platform combining AAP and SPION would be constructed in consideration of the respective advantages of AAP in accuracy and MRI in spatial resolutions. This platform would solve the problems associated with MRI techniques and provide a reliable tool for tracking MSC migration into bone defects, which is crucial for MSC homing-based bone regenerative medicine in the hope of repairing critical-sized bone defects. The current study would provide guidance in tracking the migration of cells into other target tissues as well.

借助磁共振成像术MRI对经超顺磁性氧化铁纳米粒子SPION标记的间充质干细胞MSC进行体内示踪的策略在假阳性结果和细胞存活性表征两方面存在缺陷，亟需开发一种对存活MSC进行精确定量分析的示踪技术。本项目拟通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选特异性结合MSC的核酸适配体并构建激活式核酸适配体探针（activable aptamer probe, AAP）。在体内此探针一旦结合存活的MSC即激活近红外荧光，减少组织自发荧光的干扰，达到定量分析存活MSC的目的。随后将AAP技术与MRI耦合搭建针对MSC的双模态示踪平台，结合MRI的高空间分辨率优势并弥补其在假阳性结果和细胞存活性表征上的缺陷，为研究MSC向骨折处的迁移提供可靠的示踪工具。本项目拟进一步考察归巢MSC的数量与骨缺损修复效果间的关联性及机制，为最终利用归巢MSC解决大面积骨缺损的修复这一临床难题奠定基础。

借助磁共振成像术MRI对经超顺磁性氧化铁纳米粒子标记的间充质干细胞MSC进行体内示踪的策略在假阳性结果和细胞存活性表征两方面存在缺陷，鉴于此本项目开发了一种对存活MSC进行精确定量分析的示踪技术。具体而言，我们利用基于MSC的指数富集配体系统进化（MSC-SELEX）技术，首次成功地筛选出了针对骨髓间充质干细胞的适体seq3。核酸适配体seq3特异性结合mBMSCs，但不结合肝脏和肾脏等主要器官过程中的其它细胞。然后，我们巧妙地设计了基于seq3的可激活适体探针（AAP）用于活细胞追踪，与mBMSCs的结合促使AAP探针构像发生改变，引起荧光基团与淬灭基团的分离，从而能激发荧光。AAP的激活式设计能够最小化来自非靶组织的背景信号，并且避免在MRI成像中出现假阳性和/或假阴性结果。最后，利用AAPs实时监测慢性肾脏病（CKD）小鼠模型中移植的骨髓间充质干细胞，并与广泛应用的基于Fe3O4纳米颗粒的核磁共振成像（MRI）进行实时比较。研究发现，移植的mBMSCs在正常小鼠体内分布均匀，主要聚集在肝脏，而在慢性肾病（CKD）小鼠肾脏损伤处有明显归巢行为，这一归巢行为证明有利于mBMSCs对小鼠肾脏损伤的修复。AAP探针结合MRI的高空间分辨率优势并弥补其在假阳性结果和细胞存活性表征上的缺陷，为研究MSC向肾损伤处的迁移提供可靠的示踪工具，是一种理想的体内追踪外源性骨髓间充质干细胞的工具。此项目取得了一批具有重要意义的研究成果，在国际学术期刊上发表学术论文7篇；申请专利3项；独立培养硕士、博士研究生共16人，其中6人已通过硕士学位论文答辩，1人已通过博士学位论文答辩。同时，项目负责人在项目执行期间，与国内外有关单位开展了多层次、多方位的科研合作和学术交流，与新加坡国立大学的Wang Chi-Hwa教授、中南大学湘雅二医院的张东山教授、河北大学的孙国明教授建立了良好的合作关系。相关的研究成果已在国际国内的学术会议（2017中国生物材料大会、中国材料大会2018、2019 ISBBST Conference）上以口头报告形式报道。