人类未成熟卵母细胞玻璃化冷冻—体外成熟技术及其安全性的探讨

The vitrification of immature oocytes is the most potential technique to solve the problem to establish the oocyte bank of human. Meanwhile the security of the technique is so questionable. In this study, based on the former studies, we want to: firstly, research the epigenetic changes of human oocytes during in-vitro maturation; secondly, study the distribution of mitocondrials, cortical granule,the spindle and chromosome configurations,integrity of DNA and the epigenetics of oocytes during maturation and pre/post vitrification, in order to judge the effects of in-vitro culture and vitrification on the oocytes; thirdly,evaluate the safety of several CPAs commonly used on the point of the changes of cell organelles and genetics of oocytes, so to identify the most effective but lowest toxicity CPA,to refining the protocal of vitrification of human oocytes, decrease the damage to the developmental capacity of the oocyte and increase the successful rate of cryopreservation of the oocyte. So the technique can be used as a routine technique in the clinic.Otherwise, this study can identify whether there is some relationship between the epigenetic disease and the vitrification of immature oocyte, so as to demonstrate the security of the technique. The result of this study must have far-reaching effect on the quickly developmental technique of oocyte cryopreservation.

人类未成熟卵母细胞冷冻技术作为建立人类卵子库的基础，有着广阔的应用前景。但与此同时，其安全性一直为人们所质疑。本课题在既往研究的基础上，第一，研究卵子发育不同阶段表观遗传学的变化；第二，从线粒体、皮质颗粒分布，纺锤体、染色体排布，DNA完整性，以及表观遗传学的角度，全方位，多角度的衡量未成熟卵母细胞玻璃化冷冻对于卵子的影响和改变；第三，从细胞器改变和表观遗传学的角度，评估几种常用玻璃化冷冻方案的安全性，以及检测常用冷冻保护剂（CPA）的毒性，从而明确未成熟卵玻璃化冷冻损伤的机制，筛选更为低毒高效的冷冻保护剂，完善未成熟卵玻璃化冷冻方案，进而减小冷冻对于卵子发育潜能的影响，提高未成熟卵冷冻的成功率，使其早日应用于临床。另外，从一定角度说明未成熟卵玻璃化冷冻是否与已知表观遗传学疾病有关，以证明其安全性是否可靠。此项研究必将对快速发展的卵母细胞冷冻技术产生深远的影响。

人类未成熟卵母细胞冷冻技术的安全性一直为人们所质疑。本研究在以往研究的基础上，从线粒体、皮质颗粒分布，纺锤体、染色体排布，DNA完整性，以及表观遗传学的角度，全方位，多角度的衡量未成熟卵母细胞玻璃化冷冻对于卵子的影响和改变；此外，探讨研究了新的玻璃化冷冻方案的及其安全性，从而明确未成熟卵玻璃化冷冻损伤的机制，筛选更为低毒高效的冷冻方法，完善未成熟卵玻璃化冷冻方案，进而减小冷冻对于卵子发育潜能的影响，提高未成熟卵冷冻的成功率，使其早日应用于临床。研究发现，未成熟卵母细胞经玻璃化冷冻、解冻、体外培养之后，纺锤体异常率、DNA异常率等明显升高。说明冷冻解冻过程对纺锤体形态以及DNA聚集情况产生一定的影响。随后，我们对常规玻璃化冷冻方法进行了改进：1，采用37℃的预平衡温度对卵母细胞进行玻璃化冷冻，同时探索卵母细胞玻璃化的新方法对卵母细胞的影响；改进方案2，采用生物半透膜作为分隔介质，实现冷冻液浓度的缓慢变化，最终帮助减少卵母细胞冷冻过程中形态上的骤然改变。改进后的卵母细胞冷冻方法冷冻损伤降低、冷冻效率提高。该研究探索了玻璃化冷冻对卵母细胞的影响，同时根据影响因素改进了冷冻方法，对于认识卵子冷冻损伤机制机理以及提高卵母细胞冷冻效率具有十分重要的意义。