卵丘细胞在人未成熟卵母细胞玻璃化冷冻中的作用及其机制研究

Oocyte cryopreservation is one of important approaches for preserving women fertility. However, Oocyte cryopreservation will cause irreversible damage to oocytes, and the roles of cumulus cells in the cryopreservation of human immature oocytes are still controversial. To date, the damage of vitrification cryopreservation on human oocytes especially immature oocytes and the roles of cumulus cells in the cryopreservation of immature oocytes have not been completely evaluated at molecular level. This proposal is to screen the differentially expressed genes during vitrification cryopreservation with or without cumulus cells by using gene expression profiles of single human immature oocytes, particularly examine the important genes relative to oocyte maturation, oocyte junction and cytoskeleton and apoptosis, and associated signaling pathways. Moreover, the significant findings will be verified in mouse oocytes with similar treatments. This proposal will thoroughly and deeply examine the roles of cumulus cells in immature oocyte cryopreservation at molecular level, and these data will provide strong and convincing evidence for improving the cryppreservation techniques of human immature oocytes.

卵母细胞冷冻技术是保存女性生育力的主要途径，但是卵母细胞冷冻保存易对卵母细胞造成不可逆的损伤，而且卵丘细胞在人未成熟卵母细胞冷冻过程中的作用尚无定论。迄今，还未有任何研究从分子层面全面分析玻璃化冷冻对人卵母细胞尤其未成熟卵母细胞的损伤以及卵丘细胞在未成熟卵母细胞冷冻保存中的作用。本研究拟用单个卵母细胞基因表达谱技术分析卵丘细胞在未成熟卵母细胞玻璃化冷冻过程中对基因表达的影响，重点探查与卵母细胞成熟、卵母细胞连接和骨架蛋白、凋亡相关的基因和相关通路, 并且在小鼠卵母细胞上证实我们的发现。本研究将在分子层面上全面深入研究卵丘细胞在未成熟卵母细胞玻璃化冷冻/解冻过程中的作用，为完善未成熟卵母细胞冷冻技术提供有力的证据。

卵母细胞冷冻保存易对卵母细胞造成不可逆的损伤，而且卵丘细胞在人未成熟卵母细胞冷冻过程中的作用尚无定论。迄今，还未有任何研究从分子层面全面分析玻璃化冷冻对人卵母细胞尤其未成熟卵母细胞的损伤以及卵丘细胞在未成熟卵母细胞冷冻保存中的作用。本研究的主要内容：1、卵丘细胞对玻璃化冷冻/解冻后发育潜能的影响，以人的未成熟卵母细胞为研究对象，利用裸化卵母细胞（DO）和有卵丘细胞的卵母细胞（COC） 并选择在玻璃化冷冻之前或者之后进行体外成熟，比较各组之间在卵母细胞存活率、成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率的差异。结果发现卵丘细胞对未成熟卵母细胞冷冻保存有保护作用，能明显改善未成熟卵母细胞冷冻解冻后的发育潜能。2、卵丘细胞对玻璃化冷冻解冻后卵母细胞亚显微结构的影响。在存活的卵母细胞上我们利用 Confocal 检测卵母细胞中细胞核和细胞骨架蛋白的表达和定位并且比较各组之间差异。结果发现带有卵丘细胞的卵母细胞玻璃化冷冻之前或者之后进行体外成熟，对卵母细胞纺锤体形态结构无影响，卵丘细胞对未成熟卵母细胞玻璃化冻融后纺锤体结构有保护作用。3、卵丘细胞对玻璃化冷冻/解冻后卵母细胞中全基因组表达的影响及主要差异表达基因的表达和蛋白表达验证。利用人全基因组表达谱芯片检测新鲜和玻璃化冻融后的裸化卵母细胞和 COC 中单个卵母细胞的全基因组表达。 根据基因芯片的结果，我们将要进行如下分析：1）用SAM软件按照p<0.05，2-fold (ratio>10或<-10)的标准筛选各组之间差异表达基因，通过筛选一共有78个基因满足条件，我们筛选与卵母细胞连接和骨架蛋白、凋亡相关的基因TAX1BP1 、MITD1、 TBCA、 PDCD5在小鼠卵母细胞上验证，通过逆转录方法获得cDNA，用qRT-PCR方法验证主要差异基因的mRNA表达，结果这几个基因均有表达。常规免疫荧光方法固定卵母细胞，用免疫荧光法(Confocal) 检测差异蛋白，在卵母细胞中表达定位，各组之间的差异的表达均有差异。