葡萄糖6磷酸脱氢酶和6磷酸葡萄糖酸脱氢酶对人工辅酶的偏好性改造研究

Natural cofactor (NAD(P)) dependent oxidoreductases are wildly used in biocatalysis, replacing traditional organic synthesis. The instability and high price of natural cofactors limit the industrial application of such oxidoreductases. In order to decrease the cost of cofactors, an effective solution is replacing unstable and expensive natural cofactors with stable and cheap biomimetic cofactors. In this proposal, glucose 6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase in pentose phosphate pathway are both engineered by directed evolution to regenerate stable biomimetic cofactors efficiently, aiming at solving the problems about instability and regeneration of natural cofactors during the biocatalysis process catalyzed by oxidoreductases. Then the binding modes of the mutant enzymes to biomimetic cofactors are analyzed by the bioinformatics tools and crystal structures of mutant enzymes, revealing new principles about the selectivity and specificity between dehydrogenase mutants and biomimetic cofactors, promoting the understanding of biocatalysis process, providing new thoughts about creating better biocatalysts for synthetic biology field. The fulfillment of this project will decrease the usage of expensive natural cofactors in industrial biocatalysis, expediting the transition from traditional organic synthesis to green biocatalysis.

天然辅酶 (NAD(P)) 依赖型氧化还原酶被广泛的用于可替代传统有机合成的生物催化反应中。天然辅酶的不稳定性和昂贵的价格限制了这些酶的工业化应用。使用高稳定、低成本的人工辅酶替代不稳定、昂贵的天然辅酶是降低辅酶使用成本的有效方法。在本项目中，针对天然辅酶依赖型氧化还原酶作为生物催化剂的应用研究中存在的辅酶不稳定和还原态辅酶再生的重大问题，我们拟以磷酸戊糖途径中的葡萄糖6磷酸脱氢酶和6磷酸葡萄糖酸脱氢酶为研究对象，利用定向进化相关技术，获得能够高效再生人工辅酶的脱氢酶突变体。随后通过生物信息学工具和晶体结构分析突变体酶与人工辅酶的结合模式，揭示出脱氢酶选择性和专一性识别辅酶的新规律，促进对生物催化过程化学本质的认识，为生物合成领域创造优良的生物催化剂提供新思路和方法。本项目的完成将会减少昂贵的天然辅酶在生物催化工业生产中的使用，推动传统有机合成到绿色生物催化的产业升级。

天然辅酶NAD(P)是生命体氧化还原过程中最常见的电子中介体，。绝大多数氧化还原酶都需要NAD或NADP进行分解代谢和合成代谢。天然辅酶的不稳定性和昂贵的价格限制了氧化还原酶的工业化应用，。使用高稳定、低成本的人工辅酶替代不稳定、昂贵的天然辅酶是降低辅酶使用成本的有效方法。在本项目中，我们以葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PDH）、6磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）以及利用人工辅酶NMN和BNA为研究对象目标，通过半理性分析和迭代饱和突变，分别获得了3个能够高效再生还原态人工辅酶的脱氢酶阳性突变体，Thermotoga maritima (Tm) G6PDH G31F/A32Q/T66L/P126G/L129A/Y94F/T37M、Zymomonas mobilis (Zm) G6PDH S25A/S115A/P118S/Y417H/M421L以及Sulfolobus solfataricus (Ss) GDH P194D/K215D/T251V/G275N。与野生型酶相比，TmG6PDH阳性突变体对NMN的比酶活提高了54倍，催化效率提高了71.8倍，辅酶偏好性（NMN）提高了2.1×105倍；ZmG6PDH阳性突变体对NMN的比酶活提高了57.1倍，催化效率提高了112倍，辅酶偏好性（NMN）提高了2,550倍；SsGDH-2阳性突变体对BNA的比酶活提高了20倍，催化效率提高了250倍，辅酶偏好性（BNA）提高了1.14*105倍。这三个阳性突变体酶以人工辅酶NMN/BNA为辅因子被成功应用于体外多酶体系产电、葡萄糖酶燃料电池、葡萄糖生物传感器和多种手性化合物合成。最后，通过对这三个脱氢酶的野生型和突变体酶进行晶体结构解析，结合分子动力学模拟分析，揭示了脱氢酶选择性和专一性识别人工辅酶的规律。本研究不仅促进了科研人员对人工辅酶参与生物催化过程化学本质的认识，同时为生物合成领域创造优良的生物催化剂提供新思路和方法，对于推动生物产业转型升级，具有非常深远的意义。