双相固定化酶法制备中药糖苷类成分代谢产物研究

中药制剂提取纯化技术一般以药材本身所含有效成分为目标，然而中药糖苷类成分多为前体药物，只有在生物体内肠道菌群的多种糖苷酶作用下，才能释放出相应的药效物质- - 苷元（配糖基）。.课题采用固定化糖苷酶在双相体系中体外制备中药糖苷类成分的代谢产物。研究内容包括糖苷酶的固定化方法研究及其酶学性质的测定，双相体系组成的确定；以栀子苷为模型药物制备其肠道内苷元类代谢产物，确定固定化糖苷酶双相系统催化反应的pH值、温度、振荡速率、底物浓度和反应时间等条件。在此基础上，以黄芩苷、牛蒡苷、人参皂苷等为底物，进行双相固定化糖苷酶技术在中药糖苷类成分代谢产物体外制备中的适用性研究。.课题的研究将为中药提取纯化方法的设计与创新提供新的技术手段，并为探讨中药糖苷类活性成分及其体内的代谢过程提供一种新的模式。

中药汤剂口服后，其有效成分除了以原形化合物被机体吸收发挥作用外，还有一部分需在肠内菌群的作用下转化为代谢产物后才能被机体吸收而发挥活性作用。. 课题采用固定化糖苷酶体外制备中药糖苷类成分的代谢产物。课题建立了糖苷酶活力的测定方法；确定了糖苷水解酶固定化方案；测定了糖苷水解酶固定化前后的酶学性质；以栀子苷为模型药物，完善了栀子苷的酶解工艺，进行了游离酶、固定化酶、双相固定化酶制备栀子苷元的工艺比较。研究表明将糖苷水解酶固定化以后进行酶促反应的方法，可以减少酶与栀子苷元之间的副反应，并使该酶能够反复回收利用，降低了生产成本；使用的双相系统可以在反应的同时将栀子苷元从水相中萃取到乙酸乙酯相，减少了栀子苷元自身的水解反应和酶与栀子苷元之间的副反应，提高了栀子苷元的产率，加快了反应时间，也使得产物的分离纯化更易进行。优化后的固定化酶双相体系催化栀子苷水解反应条件为：在反应体系中加入50U固定化β-葡萄糖苷酶与2.5g栀子苷，以及500ml pH 4.5的醋酸缓冲液和500ml乙酸乙酯，55℃水浴反应2.5h，栀子苷元产率可达63%左右。. 在此基础上，以黄芩苷、人参皂苷等为底物，进行固定化糖苷酶技术在中药糖苷类成分代谢产物体外制备中的适用性研究。课题比较游离酶在单相中和固定化酶在双相中水解黄芩苷的效果，两者的产率分别为 79.42%和85.28%，固定化酶双相体系反应比游离酶单相体系反应产率有明显提高；选用β-半乳糖苷酶为适宜的糖苷水解酶，它可以将20-(s)-Rg3转化为20-(s)-Rh2，且产物在构型上没有发生改变，20-(s) Rh2的转化率为74.0%。采用β-葡萄糖苷酶水解牛蒡苷、知母皂苷，牛蒡苷元的转化率可达90%，知母皂苷AⅢ产率在65%左右。. 本课题发展并完善了“双相固定化酶解技术”，建立了栀子苷元、知母皂苷AⅢ等常规水解法难以获得中药活性成分大量制备方法。课题的研究将为中药提取纯化方法的设计与创新提供新的技术手段，利用该技术体外制备需在肠内菌群的作用下转化的中药活性成分代谢产物，可以减少个体差异，达到精确给药，提高生物利用度的目的。