藤龙补中汤对大肠癌细胞衰老作用表观遗传机制研究

Cell senescence is a state of stable irreversible proliferation arrest that characterized by large and flattened morphology, cell cycle arrest and elevated senescence-activated β-galactosidase activity. Cell senescence is the well-characterized cell-intrinsic anti-cancer machinery against carcinogenesis. It has been confirmed cell senescence contributes to the outcome of cancer therapy, and has been recognized as a target for cancer treatment. Expression of cell senescence regulatory gene CDKN1a and CDKN2a is regulated by p53-mediated DNA damage response or epigenetic mechanism. .We have discovered Teng-Long-Bu-Zhong Decoction (TLBZD), a Chinese herb formula, may induce cell senescence in colorectal carcinoma cells accompanied by up-regulation of CDKN1a and CDKN2a, and down-regulation of retinoblastoma protein (RB) phosphorylation. However, p53 expression was not changed after TLBZD treatment that suggested epigenetic mechanism may contribute to TLBZD induced cell senescence. .The project will continue to explore the epigenetic mechanism of senescence-induing effects of TLBZD in colorectal carcinoma cells. To study the effects of TLBZD on gene expression/phosphorylation in CDKN1a/CDKN2a -> RB -> E2F1-> cyc E1/cyc A /CDK2/CDC2 signal pathway in colorectal carcinoma cells. To investigate the effects of TLBZD on activations of DNA methyltransferases and histone deacetylases, and DNA methylation and histone methylation/acetylation in colorectal carcinoma cells. The project will provide new insight into Traditional Chinese Medicine approaches for colorectal carcinoma treatment.

细胞衰老是细胞不可逆地脱离细胞周期、丧失增殖能力后进入的稳定状态。细胞衰老是细胞内在抗癌机制，已成为肿瘤治疗研究重要靶标。细胞衰老调控基因CDKN1a、CDKN2a表达与p53介导的DNA损伤反应或表观遗传机制相关。项目组前期研究发现解毒健脾中药藤龙补中汤可以促大肠癌细胞衰老，上调CDKN1a、CDKN2a表达，抑制RB磷酸化，但不影响p53表达，提示表观遗传可能是藤龙补中汤作用的重要机制。项目拟在前期研究基础上，从表观遗传角度探索藤龙补中汤对大肠癌细胞衰老作用机制；研究藤龙补中汤对大肠癌细胞CDKN1a/CDKN2a -> RB -> E2F1-> cyc E1/cyc A /CDK2/CDC2通路基因表达/磷酸化影响；研究藤龙补中汤对大肠癌细胞表观遗传修饰酶DNA甲基转移酶、组蛋白去乙酰化酶活性，以及大肠癌细胞DNA甲基化、组蛋白甲基化/乙酰化作用，为大肠癌中医药治疗提供科学基础。

大肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，中医药在大肠癌的治疗中发挥了积极的作用。藤龙补中汤是治疗大肠癌的现代中药方剂，本研究在动物与细胞模型中研究了藤龙补中汤对大肠癌细胞衰老的作用及其表观遗传机制。. 动物模型研究显示藤龙补中汤可以抑制大肠癌肿瘤生长；促大肠癌细胞凋亡，伴随Caspase-3，8和9活化，PARP剪辑，以及XIAP和Survivin表达下调；上调p16（CDKN2a）、p21（CDKN1a）表达，抑制RB磷酸化，促大肠癌细胞衰老；还可下调VEGF表达，抑制大肠癌血管生成。藤龙补中汤同时可增强化疗药5-Fu对大肠癌的治疗作用。. 细胞模型研究显示藤龙补中汤作用后大肠癌细胞呈现大而扁平的形态，细胞周期阻滞于G0/G1期，同时SA-β-Gal染色阳性，提示藤龙补中汤可以促大肠癌细胞衰老。藤龙补中汤可上调p16、p21表达，抑制RB磷酸化。p21 RNA干扰可拮抗藤龙补中汤对大肠癌细胞衰老的作用。p53 RNA干扰不影响藤龙补中汤对p21表达的作用。藤龙补中汤还可抑制HDAC活性，促组蛋白H3、H4乙酰化及其与p21启动子的结合。这些研究提示藤龙补中汤是通过调控组蛋白乙酰化上调p21表达，进而促大肠癌细胞衰老。. 研究进一步采用甲基化基因芯片检测了藤龙补中汤对大肠癌细胞全基因组DNA甲基化的影响；结果显示藤龙补中汤作用后，大肠癌细胞有6,628个差异甲基化基因，其中甲基化基因3,493个基因，去甲基化基因3,135，包括p16基因启动子的去甲基化。差异甲基化基因Ontology分析显示有4,810个结构基因，4,622个差异甲基化功能基因和4,323个差异甲基化生物过程基因。在信号通路方面，有1,103个差异甲基化基因，涉及信号通路75个，包括：癌通路、MAPK通路、细胞因子-受体通路等信号通路；这些结果提示调控基因启动子甲基化是藤龙补中汤作用的重要机制。. 本研究明确了藤龙补中汤对大肠癌细胞衰老的作用，初步阐明了藤龙补中汤作用的分子机制；丰富和完善了大肠癌中医治疗方法，深化了中医解毒、利湿、健脾治疗大肠癌的科学内涵，为大肠癌中医治疗提供了新的科学基础。