GidA调控猪链球菌精氨酸代谢及致病性的分子机制研究

Streptococcus suis serotype 2 (SS2) is an important zoonotic pathogen. Arginine deiminase system (ADS) , which controls arginine metabolism, is one of the most important virulence factors in SS. Our previous results, as the first time, showed that the tRNA modification enzyme GidA positively regulated the expression of ADS, however, the molecular mechanism remains unclear. Based on previous results, this research will study the regulation mechanism of ADS by GidA on both transcriptional and translational levels through surface plasmon resonance, realtime fluorescence quantitative PCR, phoA reporter system, high performance liquid chromatography and western blot. Furthermore, we will study the influence of GidA on ADS function and arginine metabolic pathways through enzymatic reaction, CFU counting, acid resistant assay and metabolomics. Finally, this study will illuminate the molecular mechanism by which GidA regulate arginine metabolism and pathogenicity, which have important theoretical and practical significance on development of new vaccines and discovery of new drug targets of infectious disease caused by SS.

猪链球菌2型（SS2）是一种重要的人兽共患病病原菌，其致病性与精氨酸代谢相关。精氨酸脱亚氨酶系统（ADS）参与调控该菌的精氨酸代谢途径。前期iTRAQ蛋白组学研究结果表明tRNA修饰酶GidA正调控了ADS的表达，但其调控机制尚不清楚，本项目拟首先通过表面等离子共振、荧光定量PCR、磷酸酶报告系统、高效液相色谱、蛋白质免疫印迹等技术，从转录水平和蛋白质水平分析GidA调控ADS表达的分子机制；然后利用酶促反应、活菌计数检测催化功能与耐酸能力，从细胞内和细胞外，研究GidA对精氨酸代谢功能的影响；进一步利用代谢组学，分析GidA对精氨酸代谢途径的扰动，最终阐明GidA调控精氨酸代谢及致病性的分子机制，为精氨酸代谢的调控机制研究积累科学数据，为新型疫苗和抗菌药物的设计与创制，乃至疫病的预防提供理论依据。

猪链球菌是一种重要的人兽共患传染病的病原菌，不仅给养猪业造成重大的经济损失，还严重威胁着人类的身体健康和生命安全。目前，猪链球菌致病机理研究是当前的热点和难点，已有文献证实猪链球菌的致病性与精氨酸代谢密切相关。精氨酸脱亚氨酶系统（ADS）参与调控该菌的精氨酸代谢途径，ADS主要由ArcA、ArcB和ArcC三种核心酶组成，其中ArcA催化精氨酸转化为瓜氨酸，同时生成NH3和ATP，瓜氨酸再经ArcB和ArcC催化降解，最终生成二氧化碳、氨和ATP。前期蛋白组学研究结果表明tRNA修饰酶GidA正调控了ADS的表达，但其调控机制尚不清楚。本项目采用同源重组技术在猪链球菌2型菌株SC19中构建了gidA基因的缺失菌株，分析了缺失菌株与亲本菌株在精氨酸代谢能力、生长特性、致病性的差异，此外通过蛋白组学和代谢组学技术，深入挖掘了GidA调控精氨酸代谢的模式。结果表明：GidA缺失后，猪链球菌的生长速度减慢、致病性减弱、精氨酸脱亚氨酶活性降低、产NH3含量减少，通过TMT蛋白组学鉴定到441个受tRNA修饰酶GidA调控表达的蛋白，发现与细胞生长、分裂、毒力、精氨酸代谢相关的蛋白下调表达，而靶向的氨基酸代谢组学鉴定到4个氨基酸的含量具有显著差异，其中精氨酸的含量在缺失菌株中显著上调。根据上述试验结果，我们提出了tRNA修饰酶GidA调控精氨酸代谢的模式：在猪链球菌中，GidA缺失后，下调精氨酸代谢核心酶ADS的蛋白表达量，缺失菌株催化分解精氨酸的能力减弱，这种调控作用从蛋白水平传导至代谢水平，从而导致精氨酸在缺失菌株体内蓄积，精氨酸得不到充分利用，造成猪链球菌的致病性减弱。