类风湿关节炎的iNKT细胞免疫治疗及其机制研究

Rheumatoid Arthritis (RA) is a kind of autoimmune disease with complex etiology, and there is still no effective medicine. Invariant natural killer T cells (iNKT) play an important role in pathophysiological process of RA. We found that the pre synthesis of immunomodulator CH （C-Pseudonucleosides Bearing Thiazolidin）can significantly promote the proliferation of iNKT cells and target killing activity, reduce the cell IFN gamma /IL-4 ratio. INKT cell activated by CH adoptive input RA mice, can effectively relieve the clinical symptoms and inflammatory injury, but the treatment mechanism of iNKT cells in RA is still not completely clear. This project aims to further work on the basis of Ja281-/- knockout mice which iNKT is deficient to construct RA model and some clinical samples as the research object, using Living imaging and pathologic technology analysis of iNKT distribution in mice and the number before and after treatment, By FACS detection technology of Th1, Th17, Treg subsets change, cells proliferation or apoptosis rate； RT-PCR and Western-Blot for the detection of inflammatory signal pathway NF- kappa B, transcription factor T-bet and GATA-3, the expression level of protein PAD4, BRAF, IL-10, IL-4 and cytokines of IFN gamma, clarifying the mechanism of iNKT cell immunotherapy of RA.

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因复杂的自身免疫病，目前仍缺乏特效药。iNKT细胞与RA的发生密切相关。我们发现，前期合成的免疫调节剂CH能明显促进iNKT细胞增殖和杀靶活性，降低细胞IFNγ/IL-4比值。将CH定向激活的iNKT细胞过继输入RA小鼠，能有效缓解临床症状和炎性损伤，但治疗机制尚不完全明确。本项目拟在原有工作基础上进一步以iNKT缺陷小鼠构建的RA模型和部分临床标本为研究对象，采用活体成像和病理学技术分析iNKT在小鼠体内分布和数量；FACS技术检测治疗前后Th1、Th17，Treg亚群变化、细胞共培养后增殖或凋亡率；RT- PCR和WB法检测炎症通路信号分子NF-κB等，转录因子T-bet、GATA-3等，蛋白分子PAD4、BRAF及细胞因子IL-4、IL-10、IFNγ的表达水平，阐明iNKT细胞免疫治疗RA的机制。

本项目拟建立类风湿关节炎（RA）的iNKT细胞免疫治疗，并探讨治疗机制。采用葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）多肽的混合片段，构建了改良的小鼠RA模型，在CD4+T细胞和iNKT细胞及免疫病理方面更加接近RA病人，复制成功率90%。继而寻找获取特定表型和功能（iNKT2亚群，产生抑炎性细胞因子）的iNKT细胞方法。小动物活体成像（IVIS）示踪： iNKT主要分布于肝、脾、肺、淋巴结等器官，体内存留42天。iNKT细胞过继输入RA小鼠后，采用系统评分法、临床病理学及免疫学指标观察，iNKT细胞治疗在临床症状、组织病理和血清学炎症因子改善等方面，均优于对照组。进一步研究揭示，iNKT细胞治疗：①通过调控GATA3, Foxp3，T-bet, RORϒt表达纠正RA小鼠CD4+T细胞亚群（Th1/Th2/Th17/Treg）失衡；②通过提高抑炎因子表达抑制过度炎症反应； ③通过上调淋巴结cDC 细胞内pSTAT3和PD-L2启动免疫检查点，诱导自身反应Th1和Th17细胞无能；同时激活cDC的pERK1/2通路，抑制NF-κB通路，诱导致耐受性cDC的生成；④还能升高RA小鼠胸腺iNKT细胞频率并纠正iNKT1/iNKT2/iNKT17亚群比例失衡。 我们已证实：通过组蛋白去甲基化酶UTX调控编码iNKT细胞分化发育关键转录因子的基因（Zbtb16, Tbx21）启动子区H3K27me3和H3K4me3修饰水平，是iNKT细胞治疗RA的表观遗传学调控机制。但IVIS显示输注的iNKT细胞并没有直接进入胸腺，因此，相关机制还有待后续研究。以上研究为RA的免疫细胞治疗提供了新的思路和方法。本项目发表学术论文18篇，其中SCI收录论文8篇，获批发明专利1项。培养毕业硕士生6名、在读博士生1名、在读硕士生6名。参加学术交流会议 10余次，提交会议论文6个。完成了项目任务目标。