基于新型双重滚环扩增技术检测多聚核苷酸激酶活性及其抑制剂的电化学生物传感研究

Aberrant T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) activity has been fully verified to closely relate with some serious human disorders. Therefore, the detection of T4 PNK activity and its potential inhibitors is of great importance in the area of nucleic acid metabolism and molecular targeted therapy. In this protect, a simple, speeding and high sensitive electrochemical biosensor will be developed for the determination of T4 PNK activity and its inhibitors as the model analytes based on the dual-rolling circle amplification. These biosensors will employ the 5'-kinase activity of T4 PNK that can catalytic the change of nucleic acid probe sequence and configuration. And the same time, enzymes and nanomaterials for signal amplification and the electrochemical technology as the detection means will be combined. A novel technological platform is constructed for the measurement of kinases activity and their inhibitors, which provides a new idea for further research on the diseases-related biochemical process and the nucleotide kinase-target drug discovery.

多聚核苷酸激酶（PNK）的活性异常与人类的许多种疾病有着密切的关系，因此开展T4 PNK活性的检测及对其抑制剂筛选在核酸代谢和分子靶向治疗研究领域具有重要的实际意义。本项目拟以T4 PNK活性检测及其抑制剂筛选作为分析对象，以T4 PNK的5'端激酶活性催化所引起的核酸探针序列及构型的转变为基础，应用双重滚环扩增技术对目标分子的信号放大作用，结合酶和纳米信号放大技术，以电化学方法作为检测手段，构建简单、快速、高灵敏度的T4 PNK活性检测及其抑制剂高通量筛选的电化学生物传感新方法和技术，为激酶的催化活性反应机理研究提供理论指导与技术支持，并为与之相关疾病的生物化学过程的监控以及核酸激酶特异性药物筛选等的研究提供一种新思路。

多聚核苷酸激酶（PNK）的活性异常与人类的许多种疾病有着密切的关系，因此开展T4 PNK活性的检测及对其抑制剂筛选在核酸代谢和分子靶向治疗研究领域具有重要的实际意义。本项目摘要完成了以下三部份工作：一是以T4 PNK的5'端激酶活性催化所引起的核酸探针序列及构型的转变为基础，合成了具有高比表面积的二氧化钛纳米管、Fe3O4@TiO2磁性纳米材料等，采用扫描电镜、透射电镜等对其进行形貌表征，利用磷酸基团可以与二氧化钛特异性结合的特点，结合核酸等温扩增、酶增大等技术对目标分子的信号放大作用，以电化学方法作为检测手段，构建了简单、快速、高灵敏度的T4 PNK活性检测及其抑制剂高通量筛选的电化学生物传感新方法和技术。二是制备了金纳米棒、生物质活性碳、碳笼等材料，研究了它们的合成原理，探索合成原料、原料配比、合成条件等对所要合成的纳米材料的化学组成、大小、形貌、性能的影响，并用扫描电镜、透射电镜等对其形貌进行了表征，将其复合制备了不同的复合材料来修饰电极，研究了芦丁、过氧化氢等在修饰电极表面的电化学行为。三是基于二硫化钼分别和金纳米棒，金纳米簇复合修饰电极来构建的电化学免疫传感器以及以DNA为模板制备铜纳米簇构建灵敏、简单的荧光适体传感器用于检测微囊藻毒素，所设计的电化学免疫和荧光适体生物传感器对MC-LR显示出高的灵敏性，该方法可以应用于实际水样中MC-LR的检测。