苦豆子总碱经Tfh细胞的“TLRs-NF-κB-Bcl-6轴”抗RA的作用及机制

Total Alkaloids from Sophora Alopecuroides（TASA）is the total alkaloid extracted medicine from Ningxia Hui Nationality plant Sophora alopecuroides L..The preliminary findings of our research group showed that TASA has a apparent anti-inflammatory and analgesic effect,which reduced the number of Tfh in rat spleen,alleviated significantly joint swelling and the expression of TLRs in the synovial tissue of CIA rat. But whether TLR regulate differentiation and function of Tfh by TASA is unclear.In this study,patients with newly diagnosed,the collagen-induced arthritis(CIA) model, the proposed application of signal inhibitors or receptor inhibitors, MACS technology, flow cytometry, Western-Blot, RT-PCR, ELISA technology and tomography, clear the pathogenesis of Tfh in rheumatoid arthritis, explore immunological mechanisms of anti-rheumatoid arthritis that TASA regulates the interaction between Tfh and autoreactive B cells via “TLR9-NF-κB-Bcl-6 axis” of Tfh. Through these research, our group want to clarify the mechanism of TASA and application in the clinical immunology treatment, provide the basis of theoretical and experimental basis for the deep development and utilization of Ningxia Hui Nationality medicine.

苦豆子总碱是从宁夏回族习用药苦豆子提取的总生物碱，本室前期研究结果表明苦豆子总碱可显著降低胶原诱导关节炎（CIA）大鼠脾滤泡辅助性T（Tfh）细胞数量，减轻其关节肿胀，抑制滑膜组织TLRs的表达。但苦豆子总碱能否经TLRs调节Tfh细胞的分化及功能从而影响生发中心（GC）的形成及自身抗体的产生尚不清楚。本研究以初发类风湿性关节炎（RA）患者及CIA小鼠为研究对象，用受体或信号蛋白抑制剂、MACS、FCM、ELISA、Western-Blot及RT-PCR等技术，证实苦豆子总碱抗RA的效果；明确Tfh细胞在RA发病中的作用；揭示苦豆子总碱经Tfh细胞的“TLRs-NF-κB-Bcl-6轴”调控Tfh-autoreactive B细胞而发挥抗类风湿性关节炎的免疫学机理。以期阐明其作用靶点和分子机制，为苦豆子总碱应用于类风湿性关节炎的临床免疫治疗，为回药的深度开发利用提供基础供理论和实验依据。

RA是因B细胞分泌大量高亲和力抗体致关节损伤的进行性炎症性自身免疫性疾病。Tfh细胞数量增加诱导自身抗原反应的B细胞活化，分泌大量自身反应性抗体，导致自身抗体介导的自身免疫性疾病。TASA是从苦豆子中提取的总生物碱，有镇痛、抗炎和免疫调节作用。本项目以初发性RA患者及构建的CIA小鼠模型为研究对象，采用形态学和分子生物学手段观察TASA经Tfh细胞的“TLRs-NF-κB-Bcl-6轴”发挥抗RA的免疫学分子机制。结果：①成功构建了CIA小鼠模型；②TASA高、中剂量组可缓解小鼠关节肿胀度并降低关节炎评分（p<0.05）；③TASA高、中剂量组关节滑膜有少量炎性细胞浸润，未发现明显的血管翳形成；④TASA高、中剂量组明显降低小鼠踝关节滑膜组织TLR2、TLR9、CXCR5、CXCL13的表达（p<0.05）；⑤TASA高、中剂量组明显降低小鼠血清IL-21、IgG、CⅡAb表达水平（p<0.05）；⑥TASA高、中剂量组小鼠脾脏指数明显降低、生发中心数量显著减少（p<0.05）；⑦TASA高剂量组小鼠Tfh细胞和B细胞的百分比显著降低（p<0.05）；⑧TASA高、中剂量组明显抑制小鼠脾Tfh细胞TLR2、TLR4、TLR9、NF-κBp65、CXCR5、Bcl-6、IL-21mRNA及其蛋白的表达（p<0.05）。⑨RA组Tfh细胞的比例高于正常对照组（p<0.01），IL-21及Bcl-6mRNA表达水平显著增高（p<0.05）；⑩RA组外周血IL-21水平显著增高（p<0.01），Tfh细胞百分比及IL-21水平与DAS28评分、ESR、RF、ACPA均呈正相关。本项目揭示了TASA可经Tfh细胞的“TLRs-NF-κB-Bcl-6轴”调控Tfh-GCB细胞而发挥抗RA的免疫学机理，为TASA在自身免疫性疾病的临床应用提供了理论和实验依据。