基于哑铃探针的环扩增超灵敏滚环扩增技术检测痕量核酸分子的研究

Nucleic acids detection is applied in varied fields including clinical laboratory. Convenient trace detection without heterothermal equipment attracts current nucleic acids detection techniques. Rolling circle amplification (RCA), as one of the most studied isothermal amplification techniques, has the advantage of convenient handling, high efficiency, and good compatibility. Introducing other amplification strategy into RCA will magnify signal further, and achieve trace detection. In this project, a novel circle to circle amplification (C2CA) strategy is introduced into RCA. By combining dumbbell probe, DNA polymerase, restriction endonuclease, and ligase, we integrate C2CA with RCA, magnify signals further, increase detection sensitivity greatly, and acquire trace detection in the absence of heterothermal equipments. By compared with similar techniques, this strategy completes detection in one step and in one tube. This strategy can be applied in trace detection of varied biomolecules including DNA, RNA, and protein. The establishment of this technique is promising to provide a more convenient platform for trace nucleic acids detection, and lay foundation of exploiting related detection kits.

核酸检测在临床检验等诸多领域有着广泛的应用。摆脱变温设备，方便快捷的实现痕量检测一直是现有的核酸检测技术所追求的目标之一。滚环扩增作为研究最多的等温扩增技术之一，具有不需要变温设备、操作简单、扩增效率高、与其他技术可融性强等优点。在滚环扩增中引入其他扩增策略，可以使信号二次放大，实现痕量检测。本项目将一种全新的环扩增策略引入滚环扩增中，通过综合运用哑铃探针、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、连接酶，实现环扩增与滚环扩增的有机结合，使检测信号进一步放大，从而大幅提高检测灵敏度，实现痕量检测的目的，同时也保留了不需要变温设备的优点。与现有同类技术相比，该策略能使检测在单一反应体系中方便快捷的一步完成。该核酸扩增技术可以应用于DNA、RNA、蛋白质等多种生物大分子的痕量检测，该技术的建立有望形成更加便捷的核酸痕量检测平台，并为相关检测试剂盒的开发奠定基础。

根据本项目设计，为筛选模板链切割保护的修饰位点，研究了常用衍生物对不同DNA聚合酶催化RCA的影响，发现2’-甲氧基修饰对RCA的强烈抑制作用，发现锁核酸、2’-氟代、磷硫酸修饰对RCA的影响较小。并建立了基于RCA的限制性核酸内切酶单链切割分析的新技术，筛选出PstI酶切保护的磷硫酸修饰的PS6位。解决了哑铃探针的衍生物修饰问题。.提出了茎环切连成环策略，并研究了哑铃探针的茎环设计中限制性核酸内切酶识别序列的位置、切割末端类型对成环的影响，并首次发现NsiI需要更长的保护碱基。研究了哑铃探针的引物起始RCA，发现切连成环较传统的splint成环法具有无背景扩增的优点，发现引物在哑铃环的结合位置影响RCA效率，并研究了引物错配对RCA效率的影响。解决了哑铃探针的茎环、引物设计和二次成环的策略问题。.我们在一次扩增的基础上优化了哑铃探针二次成环的条件，完成了一次扩增向二次扩增的转变，成功实现了DC2CA。测定了DC2CA的灵敏度、线性范围等技术指标。并与普通一次RCA（检测限3.45 fmol）进行了比较，获得其检测限为0.48 amol，提示其检测灵敏度提高了约1000倍，并在0.5~50 amol范围内有较好的线性范围（R2 = 0.982）。并以let-7家族的高保守cDNA为检测对象，通过优化初始设计，采用双环同时连接的新策略，结合二次扩增，实现了检测特异性的大幅提升，能够同时区分let-7家族的5个成员。为简化步骤，研究了酶促共反应及条件优化，并实现了切割和连接的共反应，以及聚合和切割的共反应。.作为比较，我们也用qPCR技术检测了clet-7a，获得检测限约1.57 amol，线性范围约1 amol~100 fmol。因此，qPCR技术可达相似的灵敏度，但有更宽的线性范围。然而，DC2CA不需变温设备，可常温反应，因而更适于即时检测。.为探讨生物检测对象的多样性，我们设计哑铃探针，实现了miRNA（let-7a）的直接检测。并且提出了repressor-RCA的新技术理念，设计哑铃探针，结合阻遏蛋白，首次实现了RCA对小分子半乳糖等的检测。. 通过完成项目内容，我们建立了DC2CA技术，实现了研究目的，并发表项目资助SCI文章7篇，获国家发明专利授权1项，受理2项。.