基于滚环扩增的石英晶体微天平基因传感器表面核酸直接检测技术的研究

实现对核酸分子的直接检测，是当前基因传感器技术面临的急需解决的关键问题。目前DNA探针型传感器由于多联用PCR扩增方法，需要标记、杂交等前期步骤，无法实现对核酸分子的直接检测，且存在着灵敏度和特异性偏低的问题。滚环扩增作为一种恒温核酸扩增技术，与PCR相比具有同等或更高的扩增能力，无需使用热循环仪且假阳性率更低。本研究充分利用滚环扩增技术可以在恒温条件下进行高效扩增的优点，结合石英晶体微天平对表面质量负载的高敏感性，进行石英晶体微天平基因传感器表面滚环扩增技术的研究，预期建立一种灵敏度、特异性更高，可对核酸分子进行直接检测的新技术。以石英晶体微天平基因传感器作为反应平台，通过对滚环扩增的反应体系进行研究，在晶体表面直接进行恒温扩增，从而真正实现对待测靶分子的直接检测。这一研究将为核酸分子的直接检测提供一种新型的高效检测技术，对于构建高灵敏度的新型基因传感器具有重要意义。

滚环扩增技术是一种独特的恒温扩增技术，它利用环状DNA模板的特性不断产生重复的扩增序列。通过捕获探针的特异性结合，可进一步使产物有效地固定于固相载体表面，这一特点使滚环扩增技术非常适用于传感器检测。该研究正是利用了滚环扩增的这一技术特点，将其结合于对质量负载高度敏感的石英晶体传感器，从而构建了一种新型的靶序列直接检测技术，并将其应用于临床HBV的检测。在实验中，首先在传感器金膜表面固定捕获探针，之后通过捕获探针和滚环扩增产物之间的共价结合，使滚环扩增产物结合于传感器芯片表面。石英晶体芯片表面的质量负载随滚环扩增时间的延长而不断增加，因而可以实时监测产物的浓度变化。利用DNA聚合酶的高效扩增能力及DNA链接酶的单碱基分辨能力，该方法的检测限可达到10000 copies/mL。实验结果表面基于滚环扩增的石英晶体传感器对HBV靶序列的检测特异性可达到单碱基分辨能力。通过60分钟的滚环扩增过程，对靶序列的信号放大可达到10倍。该研究实现了基于滚环扩增的石英晶体传感器的表面直接检测，探索了石英晶体传感器的响应机理，并进行了一系列临床标本的检测，验证了方法的临床应用可行性，真正完成了滚环扩增型石英晶体微天平基因传感器的构建。