基于滚环扩增的海洋产毒藻类膜分类芯片检测技术

The damage caused by harmful algae is serious in China nowadays.Specially,toxic microalgae have posed a great threat on the secure of marine food and public health. Therefore,development of effect high-throughput detection method for real-time monitoring of toxic microalgae is rather necessary.Because of its limitation for traditional method to identify harmful algae based on morphological features,all current study focus on the detection methods based on modern molecular biology. However, all current techniques could only detect single species at one time.Moreover,the practicability of the established detection methods based on gene chip,which could realize multiple detection of several species, is questionable.Therefore,this study will develop a membrane-based phylochip based on rolling circle amplification for high-throughput detection of toxic microalgae in the Chinese coast.The main work includes obtaining ribosomal gene sequences of toxic miroalgae by molecular cloning or directly downloading from Genebank, designing taxanomic probes, universal primers, and padlock probes, and designing and preparing membrane-based phylochip; labelling target nucleic acid by rolling circle amplification; using the labelled nucleic acid to hybridize with phylochip;determing the presense and absense of target microalgae in the samples by observing the colored dot on the membrane.The developed protocol is characterized by high specificity and sensitivity. This method can overcome the shortcomings of the present detection techniques based on gene chip and enhance its practical applicability, and therefore is significant for research and warning of red tide and may be used widely in the future.

我国有害藻类危害严重，特别是产毒藻类严重威胁水产品安全和公共卫生健康。因此，亟待建立有效的高通量检测技术对各种产毒藻类进行实时监控。由于传统形态鉴定法的局限性，应用分子生物技术对有害藻类进行检测成为当前的研究热点。然而，以往建立的技术只能实现单种有害藻类的检测，且现行的基因芯片检测技术实用性存在不足。本项目拟建立一种可用于我国沿海产毒藻类高通量检测的新方法-基于滚环扩增的膜分类芯片检测技术。项目聚焦于我国沿海的产毒微藻，通过生物信息学检索或基因克隆测序，获取目标藻种的核糖体基因序列，设计分类探针、锁式探针及通用扩增引物，并研制膜分类芯片，通过滚环扩增标记靶核酸，将靶核酸与膜分类芯片杂交，根据显色斑点直观判断待检样品中目标藻的有无。本研究建立的检测技术具有高特异性和高灵敏度，克服现有芯片检测技术的缺点，增强了基因芯片用于有害藻类高通量检测的实用性，因此对有害藻类研究及预警具有重要现实意义。

我国有害藻类危害严重，特别是产毒藻类严重威胁水产品安全和公共卫生健康。因此，亟待建立有效的高通量检测技术对各种产毒藻类进行实时监控。由于传统形态鉴定法的局限性，应用分子生物技术对有害藻类进行检测成为当前的研究热点。然而，以往建立的技术只能实现单种有害藻类的检测，且现行的基因芯片检测技术实用性存在不足。本项目建立了一种可用于我国沿海产毒藻类高通量检测的新方法—滚环扩增（RCA）－膜分类芯片检测技术。项目的主要研究容包括：（1）选取常见海洋常见产毒微藻作为研究对象，通过分子克隆测序获得其靶基因（核糖体大亚基rDNA）序列；（2）通过同源比对分析，设计了各目标藻的特异性锁式探针（PLP）、阳性和阴性探针、通用引物P1和P2及分类探针cZip，并对PLP和分类探针的特异性进行了验证；（3）采用尼龙膜为探针载体，通过加尾反应对分类探针进行加尾，采用紫外交联的方法固定探针，制备可用于多重杂交检测的膜分类基因芯片；（4）对RCA-膜分类芯片检测技术的各条件进行了优化，对RCA-膜分类芯片的检测灵敏度进行了评估并与PCR-膜分类芯片检测灵敏度进行比较；（5）应用RCA-膜分类芯片对模拟自然水样和环境水样进行了分析。主要结果包括：（1）成功建立了多重RCA体系，证明所设计的PLP和分类探针具有特异性；（2）成功制备出可并行分析多重RCA产物的膜基DNA阵列；（3）确定了最优检测参数：PLP连接温度61 °C，PLP连接时间70 min，RCA扩增温度64 °C，RCA扩增时间50 min，紫外交联时间1 min，探针上样量10 ng，RCA产物浓度250 ng，杂交时间2 h，杂交温度44 °C和洗膜温度50 °C；（4）确定了RCA-膜分类芯片检测技术的质粒检测限为10 copies/μL，细胞检测限为0.1 cell，比PCR-膜芯片在检测藻细胞数方面灵敏度高1个数量级；（5）证实了RCA-膜分类芯片具有较强实用性：对自然样品的分析结果显示，其检测结果与光镜镜检测结果无显著差异（P > 0.05），满足自然样品分析要求。本研究建立的检测技术具有高特异性和高灵敏度，可克服现有芯片检测技术的缺点，增强了基因芯片用于有害藻类高通量检测的实用性，因此对有害藻类研究及预警具有重要现实意义。