氧化苦参碱调节“Tfr/Tfh-IL-21-GCB细胞”轴治疗RA的机制研究

Oxymatrine（OMT) is one kind of alkaloids extracted medicine from Ningxia local plant Sophora alopecuroides L..The preliminary findings of our research group showed that OMT could correct the Th17/Treg unbalance,which down-regulated the expression of TLR9, reduced the number of Tfh cells in rat spleen,alleviated significantly inflammation in the synovial tissue of CIA rat. But whether OMT regulate Tfr/Tfh ratio, affect the formation of germinal center(GC) and the production of antibodies by OMT is unclear.In this research,the collagen-induced arthritis(CIA) model and RA patients,the proposed application of receptor inhibitors or signal inhibitors, Western-Blot,flow cytometry,MACS technology,ELISA technology and RT-qPCR,clear the roles of Tfr/Tfh ratio in rheumatoid arthritis, explore immunological mechanisms of anti-rheumatoid arthritis that OMT inhibits “TLR9-MyD88-STAT3” signals in GC B cells via regulating the “Tfr/Tfh-IL-21-GCB cells ” axis. Through these study to elucidate the mechanism of OMT and application in the clinical treatment, provide the basis of theory and experiment for the conversion of Ningxia local medicine into economic advantages.

氧化苦参碱（Oxymatrine,OMT）是从宁夏特色植物苦豆子中提取的主要生物碱之一，我们前期发现OMT可重塑胶原诱导关节炎（CIA）大鼠Th17/Treg平衡，显著降低其脾滤泡辅助性T细胞（Tfh）数量，改善关节滑膜炎症，且降低CIA小鼠滑膜组织TLR9的表达。但OMT如何调节自nTreg分化来的滤泡调节性T细胞（Tfr）/ Tfh比率失衡从而影响B细胞应答的机制尚不清楚。本研究以CIA小鼠及RA患者为研究对象，用信号蛋白或受体抑制剂、免疫印迹法、FCM、MACS及RT-qPCR等技术，明确Tfr/Tfh失衡在RA发病中的作用；证实OMT抗RA的效果；探讨OMT调节“Tfr/Tfh-IL-21-GCB细胞”轴抑制B细胞的“TLR9-MyD88-STAT3”信号通路治疗RA的免疫学机理。以期阐明其作用靶点和分子机制，为OMT的临床应用，为地方资源优势转化为经济优势提供基础理论和实验依据。

本研究首先观察了RA患者外周血是否存在Tfr-Tfh细胞比例失衡，继而通过构建CIA小鼠模型行腹腔注射OMT后观察病情缓解情况。采用多种实验技术检测Tfr、Tfh和GCB细胞及其有关细胞分子，探讨OMT调节Tfr-Tfh细胞缓解RA的分子机制。结果：①初发RA组Tfh细胞百分比增加，Tfr细胞百分比降低（p<0.05）；②Tfr细胞百分比及Tfr/Tfh比率与CRP、RF、ESR、IgG水平、DAS28负相关；Tfr/Tfh比率与IL-21和CXCL13表达负相关而与TGF-β表达正相关；③RA组外周血Tfr细胞的Blimp-1、CTLA-4 mRNA表达及蛋白表达均降低（p<0.05）；④RA患者外周血TGF-β mRNA表达水平显著降低，ICOS, CXCR5及 CXCL13 mRNA表达水平明显增加（p<0.05）；⑤成功构建了CIA模型，HE结果显示，OMT组和阻断剂组少见有生发中心形成。⑥OMT可上调小鼠血清TGF-β的表达而降低IgM、IgG、IgA的表达（p<0.05）；⑦OMT增加Tfr/Tfh细胞比例而降低B220+GL-7+细胞百分比（p<0.05）；脾Tfr细胞CXCR5、IL-21、PD-1的表达降低而Foxp3、Blimp-1、CTLA-4的表达增加（p<0.05）；⑧OMT可显著降低小鼠关节滑膜组织中TLR9、MyD88、IL-21、STAT3、p-STAT3、CXCR5的蛋白表达而上调Foxp3、Blimp-1、CTLA-4蛋白的表达（p<0.05）。⑨OMT明显降低B细胞TLR9、IL-21、STAT3的mRNA水平及TLR9、IL-21、STAT3、p-STAT3的蛋白表达（p<0.05）。本项目揭示了OMT可能经TLR9-MyD88-STAT3信号通路调控“Tfr-Tfh细胞”的免疫平衡，减少自身抗体的产生从而缓解类风湿关节炎。