c-ski对RPE细胞EMT信号调控及其在PVR治疗中的价值

The changes of retinal pigment epithelium (RPE) cells resulting from an epithelial-mesenchymal transition (EMT) play key roles in proliferative vitreoretinopathy (PVR), which leads to complex retinal fibrotic disorder and the loss of vision. Many mechanisms have been described, by which c-Ski regulates essential signaling pathways, e.g., the TGF-β pathway and exists in regulating EMT and the following process: fibrosis, collagen secretion, membrane formation and traction. So it is speculated that the regulatory function of c-ski may be helpful to treat PVR. We conceive regulating expression of c-ski to reduce extracellular matrix and stress skeleton protein synthesis and to inhibit RPE cell proliferation, migration, secretion, fibrotic membrane formation and traction. The correlation between the expression of c-ski and EMT will be observed in EMT tissue model and PVR animal model, and the change of c-ski expression in the development and progression of PVR will both be studied in the clinical and animal specimens by histopathologic examination. The effect of c-ski expression in RPE cells on extracellular matrix, fibrosis and other EMT molecules will be observed by constructing plasmid, protein electrophoresis, RT-PCR and gene chip, et al. The changes of PVR development and relevant molecules will be studied in the in vivo retina models with plasmid transfection. The study on c-ski regulatory mechanism during EMT of RPE cells may provide a fresh approach to treat PVR.

视网膜色素上皮(RPE)细胞发生上皮向间质转化(EMT)是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)发生进展的重要环节，c-ski是TGF-β等通路中重要调节分子，可调控EMT及后续过程：纤维化、胶原分泌及增生膜收缩，这可能对PVR治疗有重要意义。我们构思对RPE细胞内c-ski调控，减少细胞外基质和应力骨架蛋白合成，抑制细胞转化、迁移、胶原分泌和增生膜收缩。本课题拟在EMT组织模型和PVR动物模型研究，分析c-ski调控与EMT相关性：对临床和动物模型中组织病理检测明确它在PVR发生发展中的变化；利用构建质粒、蛋白电泳、RT-PCR、基因芯片等方法，分析c-ski高表达和抑制后RPE细胞基质分泌、纤维化及其他EMT相关过程的分子群表达变化；通过质粒转染活体视网膜，观察受转染眼PVR发生进展过程及相关分子群表达变化。探讨c-ski调节RPE细胞EMT的分子机制，可为治疗PVR提供一个新的研究思路。

视网膜色素上皮(RPE)细胞发生上皮向间质转化(EMT)是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)发生进展的重要环节，c-ski 是TGF-β等通路中重要调节分子，可调控EMT 及后续过程：纤维化、胶原分泌及增生膜收缩，这可能对PVR 治疗有重要意义。我们已完成大部分体外细胞实验和动物实验及收集部分临床资料。体外研究：①我们已经成功培养并稳定传代人RPE细胞，并鉴定，观察细胞内存在c-ski表达，早期RPE细胞核内表达c-ski较多，培养代数延长，逐渐在胞浆中表达增多。②使用慢病毒感染系统建立可以稳定表达c-ski的RPE细胞。使用流式细胞术筛选转染成功的表达Venus的RPE细胞。③ski的siRNA的设计及合成 按照siRNA合成原则，合成3对siRNAs，各组细胞Western-blot检测和RT -PCR结果验证转染能力最强的siRNA-C用于后续实验。④siRNA转染对细胞形态的影响 未转染的hRPE细胞生长旺盛；而转染48 h后siRNA-C转染组细胞活力下降。siRNA-C转染组转染hRPE细胞48 h后，转染效率为69％。⑤细胞增生活力 siRNA转染hRPE细胞增生在各个时间点均受到明显抑制。⑥细胞迁移 在12h和24h，siRNA转染hRPE细胞迁移数量明显升高。⑦通过流式细胞术进一步观察小干扰RNA（siRNA）沉默c-ski对视网膜色素上皮细胞增殖和周期的影响，siRNA沉默c-ski可以有效地抑制RPE细胞增生，该分子机制可能是抑制RPE细胞G1 期的调节子Cyclin D，造成G0/G1 期阻滞，不能进入S期。⑧RT-PCR和Western Blot检测结果发现ski抑制后RPE细胞迁移速度加快，TGF-β、VEGF、α-SMA表达上调，Occludin、ZO-1表达下调。⑨siRNA干扰方法抑制RPE细胞ski表达后，ski抑制后RPE细胞群收缩能力和细胞外基质变化较大，初步模拟PVR过程。活体研究 ①构建PVR动物模型；②活体实验结果证实c-ski质粒和siRNA可以成功转染视网膜组织，对c-ski表达有干预作用。③已收集一定数量的PVR增生膜标本，有待进一步检测c-ski表达情况。本研究证实的c-ski 调节RPE 细胞EMT 的分子机制，可为治疗PVR 提供一个新的研究思路。