弓形虫依赖唾液酸途径入侵宿主细胞机制研究

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoon, which can infect warm-blooded animals, including human, and cause zoonosis. Around one third of the human population worldwide are infected, and about 8% in China. Being an obligate intracellular parasite, T. gondii has a limited capacity to survive outside of a cell during infection, invading a host cell is therefore crucial for its survival, multiplication and the expansion of infection. The first step of the cell invasion by T. gondii is the attachment (adhesion) of the parasite to the host cell. At present, the receptors on host cell's surface recognised by T. gondii remain largely unknown. In this study, T. gondii proteins binding with sialic acid will be analyzed by affinity purification coupled with SWATH mass spectrometry technology; T. gondii specific sialic acid-binding proteins will be verified by recombinant proteins and sialic acid combination and inhibition test; cellular localization and function of key proteins will be verified by using immunofluorescence, immune electron microscopy, antibody inhibit assay and CRISPR/Cas9 gene knockout technology. This will illuminate the molecular mechanism of cell invasion by T. gondii through sialic acid-dependent pathway. Research results will not only help to reveal the mechanism of host cell invasion and pathogenesis by T. gondii, but also lay the foundation for the determination of the new anti-parasite drug targets and candidate vaccine antigens.

弓形虫是专性细胞内寄生原虫，寄生于人和温血动物，引发人兽共患病，世界约1/3人群感染，我国约8%人群感染。作为胞内寄生原虫，弓形虫在感染过程中，其在细胞外仅有非常有限的存活能力，因此虫体对宿主细胞的入侵是虫体得以存活、增殖和不断扩大传播感染的前提条件。虫体与宿主细胞结合（粘附）是入侵过程的首要环节。目前有关弓形虫在宿主细胞表面的受体还不很清楚。本项目旨在通过亲和层析结合SWATH质谱鉴定技术全面解析弓形虫与唾液酸结合的蛋白质；通过体外重组蛋白与唾液酸结合及抑制试验验证弓形虫与唾液酸特异性结合的蛋白质；通过免疫荧光、免疫电镜与抗体抑制实验、CRISPR/Cas9基因敲除技术阐明弓形虫与唾液酸结合的关键蛋白质在虫体的表达定位与功能，最终阐明弓形虫依赖唾液酸途径入侵宿主细胞的分子机理。研究结果不但有助于揭示虫体对宿主细胞入侵及致病机理，还能够为确定新的抗弓形虫感染药物靶标和疫苗候选抗原奠定基础。

弓形虫作为胞内寄生原虫，对宿主细胞的入侵是虫体得以存活、增殖和不断扩大感染的前提条件。目前有关弓形虫在宿主细胞表面的受体还不很清楚，因此，本项目拟解决的关键科学问题是弓形虫依赖唾液酸途径入侵宿主细胞机制研究。本项目通过亲和层析结合SWATH质谱鉴定技术鉴定出59个潜在与唾液酸相结合的蛋白质；通过生物信息学分析，对其中两个未知功能蛋白TgSABP1和TgTCP-1深入研究。通过唾液酸结合、抑制实验及细胞黏附实验，证明GST-SABP1和GST-TCP-1重组蛋白质可与唾液酸和宿主细胞发生特异性结合；将GST-SABP1和GST-TCP-1重组蛋白质分别与Vero细胞共孵育后，弓形虫对宿主细胞的入侵率显著降低（~60%）；抗TgSABP1的特异性抗体可明显阻断虫体的体外入侵（~70%），表明TgSABP1参与弓形虫对宿主细胞的入侵过程；采取CRISPR/Cas9方法成功构建弓形虫SABP1基因敲除株（ΔSABP1）和SABP1基因回补株（ΔSABP1-C），通过弓形虫体外入侵实验和黏附实验，证明SABP1基因缺失可导致弓形虫对宿主细胞入侵效率和黏附能力明显降低；且SABP1基因缺失延缓了弓形虫速殖子在HFF细胞的溶解周期。此外SABP1基因敲除虫株对小鼠的致病力明显减弱，且SABP1基因的回补恢复了弓形虫对小鼠的致病力，表明TgSABP1是重要黏附分子，可介导虫体对宿主细胞的入侵。综上所述，TgSABP1和TgTCP-1是弓形虫的重要配体分子，可特异性识别宿主细胞表面唾液酸分子，进而介导弓形虫对细胞的黏附与入侵过程。该研究不仅揭示了TgSABP1和TgTCP-1蛋白质在弓形虫依赖唾液酸途径入侵宿主细胞过程中发挥的重要作用，而且也为弓形虫病疫苗候选抗原和药物研究提供了一定的理论依据。