钙依赖蛋白激酶样蛋白在弓形虫入侵过程中的作用机制

弓形虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，给畜牧业生产带来巨大经济损失，同时危及到食品安全和人类的生命健康，已成为国内外关注的焦点与研究热点。阐明弓形虫的致病性及免疫机制是防控弓形虫病的重中之重。.本项目在前期的研究基础上，应用分子生物学、功能基因组学等技术手段，开展钙依赖蛋白激酶（CDPK）样蛋白在弓形虫入侵过程中的作用机制研究。将CDPK样蛋白基因导入弓形虫中，并刺激MIC蛋白的表达，研究CDPK样蛋白与MIC蛋白在弓形虫体的共定位情况，阐明二者在入侵时的关系。解析CDPK样蛋白在弓形虫不同时期的表达水平，阐明CDPK样蛋白与弓形虫入侵之间的联系。通过构建CDPK样蛋白缺失株及互补株，阐明CDPK样蛋白在弓形虫入侵过程中的生物学功能。上述研究可为弓形虫病的防控提供更充分的科学依据，同时为弓形虫药物的开发和疫苗的研制奠定理论基础。

钙依赖蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases，CDPKs）是接收并传导胞外Ca2+信号的效应分子之一，广泛存在于各种植物、绿藻和顶复门原虫中。在弓形虫中，CDPKs参与调控虫体入侵和逸出细胞、蛋白分泌、运动和分化等多种生物学功能，是一类重要的信号通路调控分子。. 本研究首先通过反转录PCR的方法获得弓形虫TgCDPK3、TgCDPK5和TgCDPK6基因，通过原核表达获得重组蛋白，制备鼠源行抗体。接着分别将TgCDPK3，TgCDPK5和TgCDPK6三个基因连接真核表达载体pVAX I后制备核酸疫苗免疫小鼠，于三免后检测其诱导小鼠产生的免疫应答反应。结果表明，三种疫苗均可以引发免疫小鼠Th1型体液和细胞免疫应答反应。经弓形虫RH株致死性和PRU株慢性攻击感染后，TgCDPK3，TgCDPK5和TgCDPK6免疫小鼠，能显著延长小鼠的存活时间，分别为13.5 d，9 d和12.2 d，脑包囊数量减少率分别为51.93%，46.81%和71.1%。说明三个抗原具有良好的免疫原性，能诱导小鼠产生较强的免疫应答以抵抗弓形虫的感染。. 随后，利用现有的弓形虫基因芯片数据库对弓形虫CDPK家族基因在不同发育时期的表达进行分析，通过模拟体内的环境分别对弓形虫速殖子进行酸性条件（pH 3.6）、碱性条件(pH 8.1)，以及高温条件(42°C) 的刺激，并通过荧光定量PCR在不同的时间点分析CDPK基因家族中各个基因的表达水平。通过上述研究我们发现CDPK家族中的大部分基因在酸性、碱性及高温条件表达均有变化，提示我们CDPK基因可能参与弓形虫应对宿主体内相应不良条件的刺激。接着我们通过间接免疫荧光的方法对CDPK5基因在弓形虫中做了定位情况，CDPK5定位在弓形虫的表面，可能参与了弓形虫与宿主的互作。通过同源重组的方法获得弓形虫CDPK5基因缺失的突变株，并对其生物学特性进行了初步分析。