抗肿瘤化合物tyrphostin AG490抑制丙型肝炎病毒NS5B聚合酶活性的分子机理研究

The current costly and time-consuming paradigm of drug discovery is ill-equipped to combat rapidly emerging diseases, such as drug-resistant bacteria and virus. One of the strategies is to identify new uses for existing drugs. Tyrphostin AG490 was mostly used as an antitumor compound though inhibiting JAK/STAT signaling pathway. In our previous study, tyrphostin AG490 had a significant effect on HCV NS5B polymerase activity. As a potential anti-HCV compound, the molecular mechanism of tyrphostin AG490 inhibiting NS5B polymerase remains to be elucidated. In this project, site directed mutagenesis will be performed to study binding site(s) of tyrphostin AG490 on NS5B polymerase using in vitro anti-NS5B polymerase activity model. Subsequently, in vivo mechanism of tyrphostin AG490 on NF-κB signaling pathway mediated by NS5B polymerase will be studied, including a number of proteins and genes that are part of NF-κB signaling pathway most likely to be affected by tyrphostin AG490. This project studies new aspects of anti-tumor compound tyrphostin AG490 which shows the possibility of developing compounds act as both anti-HCV and anti-tumor drugs.

新药研发费用及周期的持续增长，已不能满足现有疾病治疗所需，开发现有药物的新用途成为药物研发的一种重要策略。Tyrphostin AG490是一种对JAK/STAT信号通路有抑制作用的抗肿瘤化合物，前期结果表明，其对丙型肝炎病毒复制所必需RNA聚合酶NS5B的活性有明显的抑制作用，暗示其作为一种抗病毒化合物的潜力，但具体的抑制机理并不清楚。本项目拟结合氨基酸定点突变和NS5B活性检测模型，在体外研究tyrphostin AG490与NS5B的相互作用位点。同时结合实验室已有的HCV复制子体内活性分析检测体系，探索tyrphostin AG490通过NS5B蛋白作用于NF-κB信号通路的分子机理，主要包括NF-κB信号通路蛋白的变化及其介导的下游相关基因表达是否受tyrphostin AG490所影响。本项目对已有抗肿瘤化合物的新应用及新作用机制进行研究，为同时治疗HCV和肝癌提供理论依据。

前期发现抗肿瘤化合物tyrphostin AG490对丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B有明显的抑制作用。研究探讨了tyrphostin AG490体内/体外对NS5B的作用机理，结果如下：（1）体外优化丙肝病毒株1b(Con1) NS5B抑制剂筛选模型，获得最佳筛选体系，确认tyrphosin AG490抑制NS5B的IC50值为18.7 μM；（2）构建点突变蛋白△NS5B（Asp221-Ala221,Ser281-Ala281,Thr286-Ala286, Pro495-Ala495），突变rGTP结合位点Pro495，tyrphosin AG490对NS5B活性的抑制能力减弱，说明tyrphosin AG490可能通过影响NS5B结合rGTP能力来实现活性作用；（3）构建真核细胞表达载体pCMV-pmaxGFP::ns5b，且在Huh7.5细胞内成功表达NS5B。NS5B能够抑制外源导入的NF-κB-luciferase reporter的表达，即对NF-κB信号通路具有抑制作用；（4）在Huh7.5细胞中，NS5B使NF-κB信号通路中IκBα/IKKγ蛋白的降解情况受到抑制，经tyrphosin AG490处理后恢复降解现象。同时，NS5B抑制IκBα蛋白的磷酸化，tyrphosin AG490处理后恢复磷酸化现象；（5）构建NS5B真核细胞表达质粒pCMV-C-Myc:ns5b及IKKα蛋白真核细胞表达质粒pCMV-C-Flag::ikkα，免疫共沉淀结果显示在未经tyrphosin AG490处理的细胞中，NS5B能够与NF-κB信号通路中IKKα蛋白结合，处理后NS5B未能结合IKKα蛋白；（6）在表达NS5B的Huh7.5细胞中，NF-κB蛋白不能结合DNA，经tyrphosin AG490处理后，NF-κB蛋白能够与DNA相结合，说明tyrphosin AG490能够解除NS5B对NF-κB的抑制作用；同时，tyrphosin AG490能够解除NS5B对NF-κB信号通路中的IκB kinase蛋白的抑制作用；（7）Tyrphosin AG490能够减弱NS5B对Huh7.5细胞中的抗细胞凋亡蛋白Bcl-XL、XIAP和c-FLIP的表达抑制现象。以上结果丰富了抗肿瘤化合物tyrphosin AG490的应用内容，为治疗HCV和肝癌提供基础资料。