宿主细胞RacGTP酶及其相关信号通路在弓形虫入侵过程中的作用机制研究

弓形虫寄生宿主广泛，全球约有1/3人口感染弓形虫。弓形虫入侵宿主细胞后寄居于纳虫泡内。纳虫泡与弓形虫防止被宿主细胞清除、营养摄取、破出细胞等密切相关，还与宿主细胞骨架及细胞器密切关联，对自身的扩大及稳定起重要作用。我们前期研究发现弓形虫入侵时，宿主细胞的RacGTP酶参与了弓形虫纳虫泡的形成。宿主细胞PI3K-Akt-Rac信号通路在病原包括细菌、病毒侵入时起着重要的作用。本研究拟应用Rac蛋白的野生型、显性失活及组成型活化突变体基因分别转染细胞，并应用siRNA及Rac抑制剂处理细胞再用弓形虫侵染，研究RacGTP酶参与弓形虫纳虫泡形成的机制；用活性检测及抑制剂处理的的方法研究PI3K-Akt-Rac-PAK1(or WAVE)细胞信号通路与弓形虫入侵过程的关系。本研究拟首次建立宿主细胞Rac信号通路参与弓形虫入侵过程的理论，对阐明弓形虫入侵宿主细胞的机制及感染的防治具有重要意义。

弓形虫为细胞内寄生原虫，全球约有1/3人口受感染。弓形虫入侵宿主细胞后寄居于纳虫泡内，以防止被宿主细胞清除、赖于进行营养摄取和破出细胞。GTP 酶是与GTP结合并将GTP水解成GDP的一类水解酶。弓形虫感染宿主细胞时，宿主细胞由干扰素诱导产生的GTP酶Irga6和小分子GTP酶ARF6可聚集在纳虫泡膜上。GTP酶在弓形虫入侵宿主过程中起所起的重要作用促使我们进一步去探讨其它小分子GTP酶参与弓形虫感染的作用。此外，弓形虫感染使宿主细胞信号发生广泛的变化，在细胞信号水平说明弓形虫感染的机制，对探讨弓形虫与宿主细胞相互作用的分子机制，阐明宿主的抵抗策略，揭示其应答线索和调节机制具有重要的意义。我们的研究结果发现： 1. 无论弓形虫弱毒株还是强毒株，宿主细胞RhoA和Rac1 GTP酶在弓形虫速殖子感染时都会聚集在PVM上，而且这种聚集依赖于其完整的GTP酶活性。2. 弓形虫感染细胞可以激活内源性RhoA和Rac1 GTP酶，并且在弓形虫刚开始入侵细胞时开始在PVM上聚集。3.决定RhoA在PVM上聚集的结构域包括GTP/Mg2+结合位点、GAP作用位点、G1 box 或 G5 box。4.表皮生长因子（EGF）刺激感染的宿主细胞后，RhoA和Rac1 GTP酶在PVM上并没有发生移位现象，这显示RhoA和Rac1是以GTP活化形式存在于PVM上。5. 细胞过表达pECFP-RhoA WT和pECFP-Rac1 WT和转染RhoA-siRNA、Rac1-siRNA后对细胞感染率的统计数据显示RhoA和Rac1 GTP酶为弓形虫的有效入侵所必需。6. 我们应用信号转导PCR芯片技术检测并揭示弓形虫感染前、后，宿主细胞信号通路蛋白基因表达模式的变化；结合SILAC、磷酸化蛋白纯化与质谱技术，分析弓形虫感染前后宿主细胞磷酸化蛋白质谱及蛋白质Gene Ontology、磷酸化水平模式、磷酸化位点信息、及蛋白质代谢通路，从而在细胞信号水平说明弓形虫感染的机制,已获得以下成果。(1) 磷酸化蛋白质鉴定; (2) 磷酸化位点识别; (3) 高可信度磷酸化位点分布; (4) 磷酸化肽段和蛋白鉴定; (5) 宿主细胞磷酸化位点定量; (6) 磷酸化蛋白质GO注释; (7) 磷酸化蛋白COG注释; (8) 磷酸化蛋白质Pathway代谢通路注释。