环状RNA circ-Foxo3调控氧化应激诱导卵泡颗粒细胞凋亡的作用机制研究

Circular RNA circ-Foxo3 plays an important role in regulating cell cycle and cellular senescence, but little is understood about its role in oxidative stress-induced injury of follicular granulosa cells. The sequence of human circ-Foxo3 and mouse circ-Foxo3 are 91% homologous. Our studies demonstrated that circ-Foxo3 was upregulated in hydrogen peroxide (H2O2)-treated human granulosa cells and a 3-nitropropionic acid-induced mouse model of ovarian oxidative stress. Knockdown of endogenous circ-Foxo3 downregulated transcription factor FoxO3 and blocked H2O2-induced cell apoptosis. Therefore, we propose a hypothesis that “circ-Foxo3 can block MDM2 to promote FoxO3 ubiquitylation and degradation by interacting with MDM2 protein, which can influence the expression of target gene of FoxO3”. circ-Foxo3/MDM2/FoxO3 axis may regulate apoptosis and cell cycle in oxidative stress-induced injury of granulosa cells. By many methods, we will further illustrate the role and regulation pattern of circ-Foxo3 axis in follicular granulosa cells. We will also analyze its predictive value of assessing oocytes development potential and pregnancy outcome. We believe that our work will lay the foundation for indepth acknowledge of the mechanisms of circ-Foxo3 regulatory axis in granulosa cells, and provide a promising opportunity for screening non-invasive marker of high-quality oocytes.

环状RNA circ-Foxo3是调控细胞周期和衰老的重要分子，但其在卵泡颗粒细胞氧化应激损伤中的作用机制尚不明确。我们前期结果显示，circ-Foxo3在人和小鼠的同源性高达91%，在发生氧化应激的卵泡颗粒细胞中显著高表达，敲低circ-Foxo3后能降低FoxO3转录因子的水平，显著减少氧化应激诱导的细胞凋亡，促进细胞存活。据此，我们提出在氧化应激状态下的卵泡颗粒细胞中，circ-Foxo3通过与泛素连接酶MDM2相互作用，减少了MDM2对转录因子FoxO3的泛素化降解，从而促进了FoxO3下游靶基因的表达，最终导致颗粒细胞周期停滞和凋亡。我们拟从分子、细胞和动物水平探究circ-Foxo3在卵泡颗粒细胞中的功能和调控模式，并进一步分析circ-Foxo3调控轴与卵子发育潜能和临床妊娠结局的相关性及预测价值。本课题的完成将为筛选预测卵子发育潜能的无创指标提供实验基础和和新思路。

目的：女性生殖衰老与卵巢微环境密切相关，随着年龄的增加，卵巢内ROS增多，而清除自由基的能力下降，二者的失衡引起氧化应激水平升高，这与卵巢的老化过程密切相关。研究表明卵泡内ROS水平和脂质过氧化程度与胚胎质量以及妊娠结局呈显著负相关。因此，深入解析卵巢氧化应激损伤的确切分子机制，将为提高卵子发育潜能奠定理论基础。环状RNA circ-Foxo3是调控细胞周期和衰老的重要分子，但其在卵巢颗粒细胞氧化应激损伤中的作用机制尚不明确。本研究探究circ-Foxo3在卵巢颗粒细胞中的功能和调控模式。.方法：核质分离实验以及荧光原位杂交技术检测circ-Foxo3在卵巢颗粒细胞中的定位。通过H2O2和3-NP分别构建体外人卵巢颗粒细胞和小鼠卵巢组织氧化应激模型后，采用实时荧光定量PCR检测circ-Foxo3及其亲本基因FoxO3 mRNA的表达，Western blot检测蛋白的表达，免疫组化检测蛋白的定位。利用Annexin V/PI双染结合流式细胞术检测细胞凋亡水平。通过RNA pull down实验检测与circ-Foxo3相互作用的蛋白以探索circ-Foxo3的作用机制。.结果：.在人和小鼠的卵巢颗粒细胞中均能检测到circ-Foxo3的表达，主要定位于细胞质中。在氧化应激诱导的卵巢颗粒细胞凋亡事件中，环状RNA circ-Foxo3显著上调表达，FoxO3蛋白水平显著升高，而FoxO3 mRNA表达不变或者变化晚于FoxO3蛋白水平。干扰circ-Foxo3后，FoxO3蛋白水平显著降低，并降低了H2O2诱导的细胞凋亡。过表达circ-Foxo3则增加FoxO3蛋白含量并增加凋亡水平。这些结果表明，在氧化应激诱导的卵巢颗粒细胞凋亡过程中FoxO3蛋白存在转录后调控，circ-Foxo3参与了这个过程。.RNA pull down实验结果显示，Random探针组未检测到MDM2蛋白，circ-Foxo3探针组检测到MDM2蛋白，表明 KGN细胞中circ-Foxo3与MDM2蛋白结合。并且在细胞氧化应激模型中， circ-Foxo3与MDM2同时敲低组的细胞凋亡水平显著高于circ-Foxo3单独敲低组。.结论：Circ-Foxo3主要存在于卵巢颗粒细胞的细胞质中，通过与MDM2相互作用来调控其亲本基因FoxO3蛋白含量，从而介导卵巢颗粒细胞在氧化应激状态下的凋亡。