稻瘟病菌细胞周期蛋白依赖性激酶亚基（Cks1）调控形态分化和致病性的分子机制研究

Cell cycle regulation is pivotal for proper cell division and cellular differentiation in eukaryotic cells. The central regulators that govern the eukaryotic cell cycle progression are the cyclin-dependent kinases (CDKs) and their partners, which have been well characterized in the budding and fission yeasts. Recently, we have identified a Magnaporthe oryzae CKS1 gene, a homolog of yeast CKS1/SUC1, which encodes a cyclin-dependent kinase subunit. Using targeted gene deletion strategy, we have analyzed the roles of the gene in fungal morphogenesis and pathogenicity. In this project, we will further investigate the molecular mechanism of the gene in regulating these processes. The following aspects will be involved in this project: (1) Analysis of the expression of pigment synthesis and conidiation related genes in cks1 mutants; (2) Sensitivity of △cks1 mutants to cell wall stress and transcription of chitin synthesis genes in △cks1 mutants; (3) Subcellular localization of Cks1-GFP and its temporal and spatial expression pattern; (4) Functional analysis of Cks1 domains; (5) Protein interaction of Cks1 and Som1 or Cdc28 and effects of their localization by the deletion of CKS1; (6) The roles of Cks1 in cell cycle; (7) Functional analysis of CDC28 and CDC20 genes, and regulation of CDC20 by CKS1. The results of this project will be significantly important to understand molecular basis of plant infection in M. oryzae.

真核生物的细胞周期调控对正常细胞分裂和分化至关重要。在酵母中的研究表明，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）及其相关组分是决定细胞周期进程的主要调节因子。最近，我们已对稻瘟病菌细胞周期蛋白依赖性激酶亚基（Cks1）在形态分化和致病性等方面做了一系列的研究。在前期的研究基础上，本项目拟进一步研究Cks1调控的分子机制，主要内容包括：1) △cks1突变体色素合成相关基因和部分产孢相关基因表达；2) △cks1突变体对细胞壁压力胁迫的敏感性和几丁质合成酶编码基因的转录；3) Cks1-GFP融合蛋白亚细胞定位与时空表达分析；4) Cks1蛋白结构域的功能分析; 5) 稻瘟病菌Cks1与Som1、Cdc28互作，及其对蛋白定位的影响；6) 稻瘟病菌Cks1在细胞周期中的作用；7）CDC28和CDC20基因功能及CDC20表达受CKS1的直接调控。研究结果对阐明稻瘟病菌致病分子机理具有重要意义。

真核生物细胞周期的调控对细胞分裂与分化至关重要，调控过程主要涉及细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和其他相关因子。本研究针对稻瘟病菌CDK复合物亚基Cks1的生物学功能进行了较系统的研究，主要取得以下结果：1）稻瘟病菌CKS1基因在营养生长、产孢和致病性中起重要作用; 2) 稻瘟病菌CKS1基因缺失导致菌体细胞核数目减少；3）稻瘟病菌CKS1可互补酿酒酵母相应突变体的表型，禾谷镰刀菌FgCKS1也可回补稻瘟病菌Δcks1 突变体表型，说明真菌CKS1同源基因的功能具有保守性；4）稻瘟病菌Δcks1突变体的菌落色素产生明显减少、疏水性下降，但对细胞壁压力胁迫抗性显著增加；5）稻瘟病菌Δcks1突变体的黑色素合成相关基因（ALB1、RSY1 和BUF1）和产孢相关基因（COS1、CON7、ACR1、HTF1/HOX2）表达显著下调，而几丁质合成酶基因(CHS1, CHS2, CHS3, CHS5, CHS6, CHS7)和β-1,3葡聚糖合成酶编码基因(FKS1)转录表达则显著上调；6）Cks1-GFP融合蛋白主要定位于细胞质，在分生孢子和附着胞形成阶段部分融合蛋白定位于细胞核；7）营养生长、产孢以及侵染生长阶段CKS1表达水平较高，而在附着胞发育过程中CKS1表达水平相对较低；8）稻瘟病菌CDK蛋白Cdc28的亚细胞定位和时空表达模式与Cks1类似; 9）稻瘟病菌Cks1的泛素、Cdc28和阴离子结合结构域分别对Cks1蛋白发挥正常功能具有重要作用；10）稻瘟病菌Cks1分别与Cdc28 和Som1互作；11）稻瘟病菌Som1的S227是一个关键的PKA磷酸化位点，且cAMP可能通过Som1-Cks1复合体调控Pmk1-MAPK途径。研究结果对阐明稻瘟病菌细胞周期蛋白Cks1在形态分化和致病过程中的作用机制具有重要意义。