稻瘟病菌去泛素化酶基因家族在调控形态分化和致病过程中的作用

We have recently identified a novel non-pathogenic mutant Q612 using T-DNA mutagenesis approach in Magnaporthe oryzae. HiTAIL-PCR and bioinformatics analysis revealed that exogenous T-DNA was inserted into an exon of MGG_04957.6 in the mutant. The tagged gene putatively encodes ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2, which belongs to deubiquitinating enzyme family (DUBs).Since the amino acid sequence of the predicted protein shares relatively high identical to Ubp4 (Doa4), we named the gene as MoUBP4 （Magnaporthe oryzae ubiquitin-specific protease 4）. Our preliminary results showed that MoUBP4 plays key roles in regulating vegetative growth,conidiation,appressorium-mediated penetration and pathogenicity in the fungus. In this project,we will systematically investigate the biological functions of MoUBP4 and other genes encoding DUBs. The following aspects will be involved: (1) Spatial and temporal-specific expression, domain function analysis and yeast complementation of MoUbp4;(2) Determination of deubiquitinating enzyme activity of MoUbp4;(3) The roles of MoUbp4 in proteasome-dependent proteolysis;(4) Roles of MoUbp4 in protein ubiquitination using ubiquitinated protein profiling by NanoLC-MS/MS combined with iTRAQ proteomics analysis; (5) Functional analysis of other genes putatively encoding DUBs.

在前期的研究中，通过T-DNA插入突变的方法获得了一个新的稻瘟病菌致病缺陷突变体Q612。Q612突变体中的外源T-DNA插入位点位于MGG_04957的外显子内，该基因编码一个泛素羧基端水解酶，属去泛素化酶家族（DUBs）的成员之一，将其命名为MoUBP4。初步研究表明，MoUBP4在稻瘟病菌营养生长、产孢、附着胞穿透和致病性等方面起关键作用。在此基础上，本项目拟进一步阐明MoUBP4及其它去泛素化酶编码基因在调控稻瘟病菌形态分化和致病过程中的分子机理，主要研究内容包括：（1）MoUBP4基因的时空表达、结构域功能分析和酵母异源互补；（2）MoUbp4去泛素化酶活性测定；（3）MoUbp4在泛素-蛋白酶体介导的蛋白降解过程中的作用；（4）泛素化蛋白NanoLC-MS/MS和iTRAQ蛋白组学分析MoUbp4对蛋白泛素化修饰的作用；（5）稻瘟病菌基因组中其它DUBs编码基因的功能。

真核细胞蛋白泛素化可被去泛素化酶(DUBs)逆转，泛素循环对维持胞内泛素平衡、促进蛋白降解等方面起重要作用。然而，在植物病原真菌中，去泛素化酶基因家族的生物学功能尚不清楚。本项目通过T-DNA插入突变和致病缺陷突变体的筛选，鉴定获得稻瘟病菌去泛素化酶基因MoUBP4，基因敲除、互补和表型分析表明，MoUBP4的缺失导致病菌营养生长和产孢显著下降；在疏水表面，Moubp4突变体孢子萌发率、附着胞形成率显著下降，并丧失了对寄主表皮的穿透和致病性，说明稻瘟病菌MoUBP4基因在形态分化、致病性等过程中起重要作用。稻瘟病菌MoUbp4定位于细胞质，且在营养和产孢阶段表达水平较高；Moubp4突变体对细胞壁胁迫因子SDS和CR敏感性降低，并在附着胞发育过程中糖原、脂滴移动和降解速度下降。生物信息学分析发现，在稻瘟病菌基因组中除MoUBP4外还有19个预测的UBPs编码基因，除其中的4个未能敲除外，其余的15个基因均成功获得了敲除突变体；表型分析表明，缺失MoUBP14、MoUBP3、MoUBP8或MoUBP12导致稻瘟病菌生长、产孢或致病性显著下降，说明他们在病菌形态分化和致病过程中起重要作用，其它基因突变体则没有明显的表型。酵母双杂交实验发现稻瘟病菌MoUbp4与MoBro1(MGG_15323)直接互作，MoBro1又与MoSnf7(MGG_04095)存在互作；Western杂交实验表明，ΔMoubp4、ΔMoubp3、ΔMoubp12突变体的总蛋白泛素化修饰水平和游离泛素的积累均明显高于野生型，说明稻瘟病菌MoUbp4、MoUbp3和MoUbp12蛋白具有去泛素化酶的活性和功能。上述研究结果对阐明稻瘟病菌去泛素化酶基因家族在调控形态分化和致病性中的作用有重要价值。