细胞周期蛋白A及其依赖性激酶2对猪圆环病毒2型复制的调节及其分子机制

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原，其在不同种类细胞中的复制水平差异很大，且其复制受宿主细胞S期相关酶类分子调控，但目前尚不清楚哪些酶类起关键作用。研究表明，细胞周期蛋白A及其依赖性激酶2（Cyclin A/CDK2）是调节细胞S期的主要功能蛋白，其表达量和酶活性因细胞种类不同而差异很大。本研究将分别在mRNA和蛋白水平分析不同种类细胞中Cyclin A/CDK2表达量及其酶活性与PCV2的复制水平之间的关系。同时采用RNAi、药物抑制和过表达技术验证不同种类细胞中Cyclin A/CDK2对PCV2复制的调节作用，进一步通过蛋白质相互作用及蛋白质-DNA相互作用技术深入揭示其分子机制，研究结果将为阐明Cyclin A/CDK2在PCV2复制中的调节作用提供科学依据。

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是仔猪断奶后多系统消耗综合症（PMWS）的主要病原。PCV2基因组包含2个主要开放阅读框（ORFs）：ORF1编码两个复制酶蛋白（Rep和Rep’），对病毒的复制是必须的，ORF2编码衣壳蛋白（Cap）是病毒唯一的结构蛋白和主要免疫原。由于病毒基因组小，编码能力有限，因此病毒复制依赖于宿主细胞酶类。但具体是哪些分子参与调控PCV2的复制需要研究确定。本研究分析Cyclin A/CDK2表达量与PCV2的复制水平之间的关系，进一步通过蛋白质相互作用及蛋白质-DNA相互作用技术深入揭示其分子机制。通过本项目的研究，主要取得了以下研究进展：.1. 研究了PCV2在不同组织来源细胞，如猪肾细胞、猪睾丸细胞、小肠上皮细胞和血管内皮细胞等细胞中复制水平与增殖特性，PCV2在PK-15细胞中的增殖效率最高。.2. 在国内外首次克隆了猪Cyclin A和Cdk2基因并研究了其生物学功能，Cyclin A或Cdk2过表达或被抑制都会显著影响PK-15细胞周期，PCV2的复制具有S期和G2/M期依赖性。.3. Cyclin A表达量的高低与PCV2的增殖滴度密切相关，Cdk2表达量与PCV2的增殖效率相关性不显著。Cyclin A过表达能够扰乱复制酶Rep蛋白的细胞核定位。.4. 利用酵母单杂交技术筛选到宿主cDNA文库中的3种蛋白：AP2α2、ISCU和Elf4能与PCV2基因组复制起始位点的茎环结构相互作用。Elf4和ISCU基因过表达能够显著增强PCV2的复制；而AP2α2基因过表达对PCV2的复制无显著影响。AP2α2、ISCU和Elf4这3种基因被干扰表达后均可降低PCV2复制效率，表明这3种宿主细胞蛋白对该病毒复制具有调节作用。.本项目基本完成了原计划内容，阐明了细胞周期主要调控分子Cyclin A和Cdk2基因对PCV2复制的调节作用及机制，对于Cyclin A过表达能够扰乱复制酶Rep蛋白的细胞核定位的具体作用机制还需要进一步深入研究，3种宿主蛋白调节PCV2复制具体机制需要深入研究。