稻瘟病菌cAMP-PKA信号途径下游基因调控网络及其功能研究

In previous studies, we identified two novel transcriptional regulators MoSom1 and MoCdtf1, which are essential for infection-related morphogenesis and pathogenicity of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. MoSom1 is a homolog of Saccharomyces cerevisiae Flo8. Our experiment results show that MoSom1 functions downstream of cAMP-PKA signaling pathway and physically interacts with MoCdtf1 and MoStu1(an APSES transcriptional factor). Based on these results, this project will investigate the gene regulatory network of downstream from the cAMP-PKA pathway and its roles in regulating infection-related morphogenesis and pathogenicity by this fungus. The following aspects will be involved in the project: (1) Functional analysis of the predicted PKA phosphorylation sites and various splicing isoforms of MoSom1;(2)Biological function of the genes encoding the proteins with LisH domain in Magnaporthe genome and the proteins interacting with MoSom1;(3)Cross talk at the downstream of the two signaling pathways:cAMP-PKA pathway and MAPK pathway;(4)Targeted deletion and functional analysis of several genes regulated by cAMP-PKA pathway. Above research results will further elucidate molecular machanism of M. oryzae cAMP-PKA signaling pathway in fungal morphogenesis and pathogenicity.

在先前的研究中，我们鉴定了2个新的稻瘟病菌转录调控因子MoSom1和MoCdtf1，它们在稻瘟病菌形态分化和致病性中均起关键作用。实验证明，稻瘟病菌MoSom1与酿酒酵母Flo8同源，MoSom1作用于cAMP-PKA信号途径下游，并与MoCdtf1和MoStu1（APSES转录因子）互作。在此基础上，本项目将研究稻瘟病菌cAMP-PKA途径下游的基因网络及其调控该菌形态分化和致病性的分子机制，主要研究内容包括：（1）MoSom1的PKA磷酸化位点、剪切方式对其功能的影响；（2）稻瘟病菌基因组中含LisH结构域蛋白及与MoSom1互作蛋白编码基因的功能；（3）稻瘟病菌cAMP-PKA途径与MAPK途径下游的cross talk网络；（4）受cAMP-PKA途径调控的基因功能。研究结果将进一步阐明稻瘟病菌cAMP-PKA途径调控形态分化和致病性的分子机理，意义重大。

稻瘟病菌MoSom1是一个与酿酒酵母Flo8功能同源的转录调控因子，作用于cAMP-PKA信号途径下游。本项目主要对MoSom1 PKA磷酸化位点、不同剪切体功能、互作蛋白及cAMP-PKA下游调控网络等进行了研究。通过对8个推测的MoSom1 PKA丝/苏氨酸（S/T）磷酸化位点分别进行定点删除突变，以及进一步的氨基酸残基替换突变（将S227突变为A、E、V或Y）和以第227位氨基酸单磷酸化多肽抗体为探针的Western杂交分析，证明了S227是对MoSom1生物学功能起关键作用的PKA磷酸化位点。通过对稻瘟病菌MoSom1的6种不同剪切体（I1~I6）互补△Mosom1突变体的表型分析，发现MoSom1不同剪切体均有正常的生物学功能。稻瘟病菌基因组中除已报道的MoSOM1和TIG1外，还有另外5个含LisH结构域的蛋白编码基因，基因敲除和突变体表型分析的结果表明，敲除MGG_00753基因仅引起菌落色素和致病性的微弱下降，MGG_01665和MGG_04137基因敲除突变体则没有明显表型，而敲除MGG_06742或MGG_09369基因可能是致死的。利用亲和纯化、SAGE表达谱测序和酵母双杂交（Y2H）等方法获得了与MoSom1互作的蛋白Cks1。△cks1突变体营养生长缓慢、菌落色素产生减少、不能产生分生孢子，同时丧失了对大麦和水稻的致病性。另外，阐明了稻瘟病菌转录因子Znf1在调控病菌形态分化和致病性中起重要作用，并通过qRT-PCT、Western杂交、Y2H等方法明确了稻瘟病菌转录调控因子MoSom1和Znf1参与cAMP-PKA和MAPK信号途径的cross talk。上述研究结果进一步阐明了稻瘟病菌MoSom1的作用分子机制，加深了对cAMP-PKA信号途径调控网络的认识。