黑果枸杞花青素苷合成关键酶基因及上游调控序列的克隆与表达分析

There are many of magenta pigment which is a kind of natural anthocyanin in L.ruthenicum Murr fruit ,which is an outstanding fruit in black food.In this study,different in transcriptional level in fruit of Lycium barbarum L.var. auranticarpum K. F. Ching , L.ruthenicum Murr and Lycium barbarum L.are compared by RT-PCR method,involving many key enzyme gene,such as CHI、F3H、F3′H 、DFR、F3′5′H、ANS、UFGT, in the pathway of anthocyanin synthesis.Some key gene are attained,and clone them,which are strong linked to the target gene of anthocyanin synthesis in L.ruthenicum Murr fruit.Full cDNA is amplificated by RACE and the sequences are analysised by bioinformatic method.The target gene transcriptional characters and difference on root,stem,leaf etc are detected by real time PCR.The expressal vector is constructed and is transformed into Nicotiana tabacum in order to investigate its function.This study focus on the mechanism of pigment formation in L.ruthenicum Murr fruit,which provide theoretical base for moleculal regulation and get read for breeding the high anthocyanin wolfberry.

黑果枸杞成熟浆果中富含紫红色色素，是典型的天然花青素苷类植物色素，是黑色食品的佼佼者，本项目首先通过RT-PCR分析比较花青素苷合成中的关键酶基因（CHI、F3H、F3′H 、DFR、F3′5′H、ANS、UFGT）在黑果枸杞、红果枸杞、黄果枸杞果实中的表达差异，分析获得与黑果枸杞果实花色素苷合成紧密相关的目的基因（群），然后克隆该目的基因，通过RACE技术扩增其全长，分析其序列特征；利用实时荧光定量PCR检测该目的基因在黑果枸杞果实成熟过程中的表达特性，及在黑果枸杞根、茎、叶片等组织器官中的表达差异情况，最后构建植物表达载体转化烟草进行转基因功能验证。旨在探索黑果枸杞果实呈色的机制，为其分子调控、培育枸杞新品种提供理论依据，为培育高花青素苷含量枸杞打下理论基础。

一、项目研究背景 . 黑果枸杞成熟果实中富含紫红色色素，是典型的天然花青素苷类植物色素，是黑色食品 的佼佼者，近年来备受人们的喜爱。目前，对黑果枸杞的研究，主要集中在人工驯化与栽培、色素提取等方面，探讨分析花青素合成的分子生物学机理，对于不同颜色果实品种的选育具有重要的理论意义和实际应用价值，本研究通过探讨果实颜色与结构基因表达与果实颜色之间的关系，期望为基因工程育种提供更多的基因资源和参考依据。. 二、主要研究内容 . 本项目以黑果枸杞为研究对象，克隆其花青素合成过程中的结构基因CHI、CHS、F3H、F3’H 、DFR、F3’5’H、ANS、UFGT，并分析这些基因在黑果枸杞不同发育时期果实中与其他颜色枸杞果实的表达差异，找出黑果枸杞花青素合成的关键酶基因。. 三、取得主要结果 . 1.高效液相色谱法测定了黑果、红果、白果、黄变、黄果枸杞果实中的花青素，结果显示黑果枸杞果实中还有大量花青素，而且果实发育的后3个时期是花青素积累的主要阶段，白果枸杞、黄变枸杞中含量极微量的花青素，红果枸杞和黄果枸杞中不含花青素。. 2.同源克隆了黑果枸杞花青素合成途径中的CHI、F3H、F3’H 、F3’5’H、DFR、ANS、UFGT等结构基因片段；采用荧光定量PCR的方法分别分析了这些基因在枸杞不同颜色（黑果枸杞、红果枸杞、黄果枸杞、黄变枸杞、白果枸杞）不同发育时期的表达模式，结果表明，F3’H 、F3’5’H可能是黑果枸杞形成花青素的关键酶基因；将关键基因在黑果枸杞不同组织器官（根、茎、叶、花、果实）中进行表达分析，结果显示，F3’H基因，在黑果枸杞根茎叶花各组织中均有表达，在果实中表达最低，花中最高，其次为叶、根、茎；F3’5’H基因，在黑果枸杞茎叶花果实各组织中均有表达、在根中几乎检测不到； . 3.构建了用于功能验证的F3’5’H基因的CRISPR-CAS9表达载体。 . 4. 培养科技骨干2名，发表科技论文2篇，录用1篇。