MeERF1调控木薯蔗糖合酶1基因的分子机制及其对淀粉合成影响的研究

cassava sucrose synthase is one of key enzymes to determine the sink strength in storage organ, also is the first enzyme for starting the transformation of sucrose to starch. This study focuses on the regulation mechanism of cassava sucrose synthase gene and wants to uncover the inner mechanism of high efficiency starch biosynthesis in cassava. MeERF1 was considered as a candidate regulator of MeSuSy1 gene according to the former Y1H assay and other confirmatory experiments. This project will carry on the in vivo and in vitro interaction confirmation between MeERF1 and MeSuSy1 promoter, and construct over-expressed and knock-out vectors of MeERF1 to transform cassava variety. Once obtained positive transgenic cassava lines, detect their starch contents, starch components, reducing sugar contents, etc, the transcription activities and enzyme activities of starch biosynthesis related genes in storage roots. Comparing these data to wild type cassava line, we will explore the molecular mechanism of MeERF1 regulating MeSuSy1 gene and other starch biosynthesis related genes, and then illuminate the functions of MeERF1 in starch biosynthesis pathway comprehensively, and the influence to starch biosynthesis when the enzyme activity of sucrose synthase is changing.

蔗糖合酶是决定植物贮藏器官库强的关键酶之一，也是开启蔗糖向淀粉转化的第一个酶。本研究期望从木薯蔗糖合酶基因的调控机制入手，揭示木薯淀粉高效累积的内在机制。前期通过酵母单杂交和相关验证实验，发现MeERF1是调控MeSuSy1基因的候选转录因子。在此基础上，本项目将继续对MeERF1与MeSuSy1基因启动子区的体外和体内互作进行重复验证，并构建MeERF1的过表达和基因敲除载体转化木薯，通过比较转基因株系和野生型间块根淀粉含量、组分、还原糖含量等性状，以及块根中MeSuSy1和其它淀粉合成相关基因的转录活性和酶活变化，探究MeERF1对MeSuSy1基因的调控机制，和对其它淀粉合成相关基因的调控程度，全面阐述MeERF1在淀粉合成途径中的功能，以及蔗糖合酶活性变化对木薯淀粉累积效率的影响。

蔗糖合酶是决定植物贮藏器官库强的关键酶之一，也是开启蔗糖向淀粉转化的第一个酶。本研究从木薯蔗糖合酶基因SuSy的调控机制入手，揭示木薯块根淀粉生物合成的调节机制。本研究在获得ERF1（据与拟南芥基因的同源性将其正式命名为MeERF72）可溶性纯化蛋白后，利用DPI-ELISA技术证实ERF72的AP2结合域能够与SuSy1启动子在体外结合，通过对SuSy1启动子的特定部位进行缺失，发现ERF72的AP2结合位点在启动子的–1384 to –1376 bp区域，而且该区域的确存在一个乙烯响应元件ERE（TTTGAAAT）；双荧光素酶实验发现ERF72可负向调控SuSy1启动子的转录活性，而且其转录激活区域位于aa212-aa241区域；ERF72以二聚体形式发挥功能，且定位于细胞核内。随后构建ERF72过表达和RNAi载体，转化木薯C3胚性脆愈伤，分别得到经过生根筛选的转基因阳性株系4个和5个，其中4个过表达株系和1个RNAi株系得到Southern Blot鉴定，其余株系还有待补充鉴定。转基因阳性苗炼苗移栽花盆，10个月后收获并初步调查性状发现：干扰株系块根干物质率高于野生型C3，而过表达株系块根干物质率略低于野生型C3；干扰株系块根淀粉率高于野生型C3，而过表达株系块根淀粉率略低于野生型C3。过表达株系转基因植株中，ERF72的表达量显著高于野生型和RNAi株系，SuSy1的表达量低于野生型和RNAi株系，其他淀粉合成相关基因表达量变化规律不明显，有待进一步考查。本研究初步证实了植物激素乙烯可通过其信号途径参与木薯块根淀粉合成调控，并能够在一定程度上降低木薯块根淀粉合成效率，为木薯块根淀粉合成效率的遗传改良提供基因资源和方向指导。