DLBCL中组蛋白去乙酰化酶表达谱及其抑制效应的分子机制探讨

Histone deacetylase inhibitors (HDACis) has been used in clinical trial for patients with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), however, HDACs expression profiling in DLBCL and the exact molecular mechanism of their antitumor effects remains unknown. We will first detect the protein and mRNA expression pattern of class I (HDAC1,2,3,8), class II (HDAC 4、5、6、7、9、10) and class IV(HDAC11) in DLBCL and reactive lymphoid hyperplasia samples by immunohistochemical and real-time quantitative PCR-based analysis, and investigate their correlation with patients' clinic pathological features. Under clarification of the expression level of each HDAC in various DLBCL cell lines, we will then treat DLBCL cell lines and DLBCL-bearing mice with non-specific and selective HDACis, respectively, the status of histone H3 and H4 acetylation and effects on biological behavior will be further analyzed. By the methods of site-directed mutagenesis and gene transfection, we will finally alter the p53 gene status and bcl-6 expression level in DLBCL cell lines and compare their functional effects after HDACi treatment both in vivo and in vitro. The study will throw light on the carcinogenesis of DLBCL from the view of acetylation modification and will give a solid basis for selective applification of HDACi treatment for DLBCL patients.

组蛋白去乙酰化酶抑制剂（ HDACis）已进入DLBCL治疗临床试验，但不同HDACs在DLBCL中的表达情况及其抑制效应的分子机制尚不清楚。本课题将首先用免疫组化和荧光定量PCR法分别检测DLBCL和淋巴结反应性增生组织中I型HDACs 1、2、3、8，II型HDAC 4、5、6、7、9、10，IV型HDAC11的蛋白和mRNA表达，分析其表达谱型及其与临床病理和预后的关系；在明确DLBCL细胞株中各HDACs的基础上，分别用广谱HDACi和RNAi选择性抑制法分别作用于DLBCL细胞株和小鼠移植瘤，观察核心组蛋白H3和H4的乙酰化状态及其抑制作用的差异；最后用定点突变、RNAi和基因转染分别改变p53基因型和bcl-6表达，观察其在体内外对HDACi作用效应的影响。本研究的完成将从乙酰化修饰角度进一步认识DLBCL发病机制，并对HDACi的选择性应用具有重要意义。

弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)发病机制尚不清楚，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)是有前景的肿瘤治疗靶点并开始用于某些类型淋巴瘤的治疗，其在DLBCL中的表达状态及其效应机制迫切需要研究。本项目首先DLBCL细胞株中HDACs的表达及其抑制效应，发现HDACs在DLBCL中呈差异性表达，HDAC广谱抑制剂抑制肿瘤生长、促进细胞凋亡和细胞周期阻滞，p53、cyclinD及AKT信号通路参与生长调控机制。同时应用NanoString nCouter高通量、高敏感检测平台对DLBCL临床样本及细胞系进行HDACs（四大类，18个亚型）mRNA表达谱分析，结果发现HDAC6 mRNA在DLBCL临床样本和细胞系表达均显著上调，通过qPCR进一步证实。用IHC法检测了151例DLBCL组织中HDAC6蛋白表达，31.8%DLBCL中表达显著上调，并与临床预后差相关。进一步开展了HDAC6体内外系列研究，体外实验显示：HDAC6 敲除/过表达可抑制/促进DLBCL细胞增殖、诱导细胞凋亡。动物实验显示：shHDAC6/HDAC6过表达可延缓/促进DLBCL移植瘤形成时间、抑制肿瘤生长速度。机制研究发现HDAC6可通过抑制HR23B功能实现对MET信号通路的活化作用，HDAC6通过HR23B相互作用下调后者，而HR23B可上调MET蛋白特异性泛素连接酶E3(c-cbl)，从而导致MET泛素化降解减少、MET高表达。课题还评估了romidepsin、ricolinostat以及MET抑制剂crizotinib对DLBCL裸小鼠抑制瘤形成、生长抑制疗效，发现各药物单独使用均表现出一定抑制效果，但romidepsin／crizotinib联用或ricolinostat／crizotinib联用效果均显著优于单用各药。通过上述研究明确DLBCL中HDAC6的癌基因样功能，HDAC6可作为DLBCL预后评价指标之一，并提出HDAC6－HR23B－MET调控轴理论，为HDAC抑制剂与MET抑制剂药物联用提供理论基础，本项目的完成对进一步解析DLBCL发病机制、探寻制定新型靶向治疗策略具有重要意义。