细胞骨架蛋白ADD1对A群轮状病毒的抑制作用及其分子机制研究

Group A rotavirus (RVA) is a major cause of acute viral gastroenteritis in children and young animals worldwide, posing tremendous threats to human health and animal husbandry development. RVA infection disrupts the cytoskeleton, penetrates through the cell membrane, and induces diarrhea. However, the role of cytoskeletal proteins in RVA infection is not clear. Our previous studies of RVA-host interactions revealed that host cytoskeletal protein ADD1 potently interacts with RVA outer capsid protein VP4, and that ADD1 inhibits the proliferation of human and porcine RVAs, although the underlying mechanism remains elusive. Based on these preliminary findings, here we plan to 1) analyze the inhibitory role of ADD1 in the replication of RVA both in vivo and in vitro, 2) identify its functional antiviral domains and key amino acid sites, 3) explore how ADD1 phosphorylation, regulation of actin filaments and ion transporter affects RVA replication, 4) investigate the molecular details and biological significance of the interaction of ADD1 and VP4. Collectively our study will reveal the molecular mechanism of ADD1 inhibition of RVA replication and lay the foundation for better understanding the mechanism(s) of pathogenesis of RVA, thereby providing theoretical basis and scientific basis for developing the safe and effective new vaccine.

A群轮状病毒（RVA）是引起婴幼儿和多种幼龄动物发生严重急性胃肠炎的主要病原之一，给人类健康和畜牧业发展造成巨大危害。RVA感染首先破坏细胞骨架，突破细胞膜，引发腹泻，但细胞骨架蛋白在RVA感染中的作用并不清楚。前期开展的RVA和宿主细胞的相互作用组学研究发现，细胞骨架蛋白ADD1与RVA外壳蛋白VP4存在较强的相互作用，并且可以抑制人和猪RVA的增殖，但其作用机制尚不清楚。本项目拟进一步从体内和体外两方面系统分析ADD1在RVA增殖过程中的作用，确定其发挥作用的功能域或关键氨基酸位点，明确其抑制RVA增殖的具体环节，探讨ADD1磷酸化、调节actin以及离子转运等功能对RVA增殖的影响，解析ADD1与VP4互作的分子细节及生物学意义，揭示ADD1抑制RVA增殖的分子机制，为进一步阐明RVA的致病机制奠定基础，为研制更加安全有效的新型疫苗提供理论依据，具有重要的理论和实践意义。

猪轮状病毒（PoRV）可引起新生仔猪的急性和传染性肠炎，对养殖业的发展造成严重危害。Adducin1（ADD1）是一种细胞骨架蛋白，具有多种生理功能。VP4蛋白是轮状病毒最重要的结构蛋白，参与病毒入侵细胞。然而，ADD1在PoRV复制中的作用仍有待探索。我们构建了ADD1敲除细胞系，并将其过表达质粒导入293A细胞，并感染PoRV，以分析ADD1对PoRV和另一种源自猴的轮状病毒株SA11的作用。结果表明ADD1在体外可以抑制PoRV和SA11的复制。我们还进行了ADD1-敲除小鼠的体内实验，设计并获得了ADD1敲除小鼠，用轮状病毒NJ2012和猴SA11毒株对ADD1-KO小鼠进行攻毒实验，ADD1-KO小鼠表现出更严重的症状，在肠道中具有更多的病毒载量，这表明ADD1限制了体内轮状病毒的复制。为了找出ADD1抑制RV复制的机制，我们通过免疫共沉淀和共聚焦实验发现VP4可以与ADD1相互作用。我们还利用突变型ADD1和PKA、PKC途径的抑制剂来分析ADD1参与的信号转导途径。令人惊讶的是，PKA和PKC磷酸化突变的ADD1可以限制PoRV的复制，ADD1利用PKA和PKC信号转导来辅助PoRV复制，尽管ADD1对PoRV具有抑制作用。然而，抑制Na+和K+ATP酶可以消除ADD1的抑制作用。这表明ADD1上的Na+和K+离子转导是限制PoRV复制的原因。总之，我们的发现揭示了ADD1对RV感染，尤其是对猪轮状病毒感染的良好抗病毒作用。ADD1可以显著不同的效果调节猪轮状病毒复制。