MicroRNA-520b对肝癌的抑制作用及其分子机制研究

申请者前期研究发现，microRNA-520b在肝癌细胞中表达下调，可明显抑制肝癌细胞克隆形成，提示microRNA-520b可能作为抑癌microRNA发挥功能。已筛选到的靶基因有cyclinD1、MEKK2和MLK3，它们与细胞增殖转化功能密切相关。本项目将在前期研究工作基础上，进一步探讨microRNA-520b对肝癌的抑制作用及其分子机制，主要研究内容：建立稳定表达microRNA-520b的肝癌细胞系，观察其对裸鼠成瘤的抑制作用；进一步筛选靶基因，对其做进一步分析，通过免疫组化观察靶基因在肝癌组织中的表达情况；对靶基因作用的分子机制进行深入研究，通过RNA干扰靶基因（或过表达）观察其对肝癌生长抑制作用的影响，从而阐明microRNA-520b抑制肝癌细胞生长的作用途径。本研究将为microRNA-520b作为抑癌microRNA提供实验证据，有助于进一步丰富肝癌发生的分子机理。

MicroRNAs (miRNAs) 是一类长度在 19~24 个核苷酸(nt)的内源性非编码单链小分子RNA。近年来研究发现，miRNAs在肿瘤的发生发展中具有重要的作用，可作为癌基因或抑癌基因促进或抑制肿瘤的发生。本项目中，实时定量PCR方法发现，miR-520b在11例临床肝癌标本中和4个肝癌细胞系 (HepG2, H7402, MHCC-97L, MHCC-97H) 中均呈低表达。应用克隆形成实验、EdU增殖实验和MTT实验检测结果显示，miR-520b可以在体外抑制肝癌HepG2/H7402细胞的增殖。通过生物信息学分析发现，cyclin D1和MEKK2是miR-520b的两个潜在的靶基因。利用报告基因和免疫印迹实验检测发现，miR-520b可以直接靶向cyclin D1和MEKK2的3′UTR区域，并抑制其翻译。EdU增殖实验和MTT实验检测结果显示，cyclin D1和MEKK2具有促进肝癌HepG2/H7402细胞增殖的作用。此外，裸鼠成瘤实验结果显示，miR-520b在体内具有抑制肝癌HepG2细胞生长的作用。上述结果表明，miR-520b可以通过靶向cyclin D1和MEKK2发挥抑制肝癌细胞生长的作用，提示miR-520b可能是一个抑癌的miRNA。miR-520b在肝癌的诊断和治疗中具有应用价值。