甲状腺素调节仔猪睾丸支持细胞增殖的分子机制

睾丸支持细胞的适度增殖不仅决定了成年动物精子生成能力,而且也是睾丸发育和精子发生启动及维持所必须的，但甲状腺素如何通过受体、蛋白激酶调节睾丸支持细胞增殖与分化目前尚不清楚。本项目拟以仔猪睾丸为研究对象，采用体内、体外模型，通过诱导支持细胞同步化、添加激动剂和抑制剂，使用免疫组化、流式细胞术、免疫印迹、荧光定量 PCR 和RNAi等技术，在确定参与细胞增殖调节的受体的基础上，分析Src-Erk1/2 和PI3K/Akt/mTOR在睾丸支持细胞增殖调节中的信号传导，最后分析甲状腺素如何通过受体、蛋白激酶调节细胞周期关键调控蛋白Rb的磷酸化水平，以阐明甲状腺素调节支持细胞增殖的分子机制。本研究将为深入认识雄性性腺发育的分子机制，丰富生殖内分泌领域的知识提供基础数据。

睾丸支持细胞在哺乳动物的精子生成过程中具有重要的支持和营养功能，研究其增殖分化调节机制对于提高雄性动物的决定了成年动物的生殖能力具有十分重要的理论和临床诊疗意义。近年来的研究发现，甲状腺素在睾丸支持细胞增殖/分化调节中发挥了十分重要的作用，但其具体的作用机制尚不清楚。本项目以仔猪睾丸支持细胞为研究对象，利用体内外模型，开展了以下几个方面的研究：. （1）甲状腺素受体在不同发育阶段仔猪睾丸中的表达：以0周、3周、5周和12月龄的全同胞或半同胞仔猪睾丸为材料，利用免疫组化、免疫印迹和荧光定量PCR分析了不同发育阶段中TRα的表达；同时采用流式细胞术测定了睾丸支持细胞、生精细胞数量和增殖能力变化以及支持细胞的成熟分化状况。. （2）甲状腺素对体外培养睾丸支持细胞增殖的影响：利用体外培养的支持细胞，分别添加不同浓度的T3 (0.1, 1, 10, 100, 1000 nM) 培养12h，利用CCK8和流式细胞术检测细胞的数量和增殖。再用T3（(100 nM)）刺激支持细胞12, 24, 36和48h，利用CCK8和流式细胞术检测细胞的数量和增殖。. （3）甲状腺素调节仔猪睾丸支持细胞体外增殖的作用机制：我们选取体外培养的支持细胞作试验模型，重点研究T3通过PI3K/Akt信号通路调节SC增殖/分化的作用机制。以不添加激素为对照组，设置FSH组，T3组，以及FSH+ T3组。利用CCK8和流式细胞术检测细胞的数量和增殖，利用Western blot检测蛋白的活性，利用定量PCR检测相关基因的表达，通过添加各种蛋白酶的抑制剂反向证明信号通路的作用。.结论：.（1）随着仔猪睾丸支持细胞的发育，其增殖能力在3周龄达到最强，随后逐渐降低。TRα1的表达量则随睾丸的发育逐步降低，表明甲状腺素可能参与支持细胞增殖/分化的调节。.（2）T3对仔猪睾丸支持细胞增殖具有调节作用，其调节呈现一定的时间- 剂量依赖性，适宜的刺激浓度为100 nM; T3对体外培养的支持细胞适宜的反应时间为24h。.（3）T3通过与其受体TRa1结合，继而引起PI3K / Akt级联的信号路径将其抑制效应传导到下游，引起P27的表达增强，细胞周期相关蛋白如cyclinA2，cyclinD1，cyclinE1，Skp2的表达下调，最终引起PCNA蛋白表达量下降，迫使睾丸支持细胞从细胞周期退出并开始分化。