雌激素调节仔猪睾丸支持细胞增殖的分子机制

睾丸支持细胞的增殖能力决定了成年动物精子生成能力和移植器官的成活时间,但雌激素如何通过受体、蛋白激酶调节睾丸支持细胞的增殖目前还不清楚。本项目以新生仔猪睾丸为研究对象，采用体内、体外模型，通过诱导细胞同步化、添加激动剂剂和抑制剂，使用免疫组化、流式细胞术、免疫共沉淀、confocal、免疫印迹、荧光定量 PCR和RNAi等技术，在确定参与细胞增殖受体的基础上，分析ERK1/2和PI3K如何激活mTOR系统,最后分析雌激素如何通过受体、蛋白激酶调节细胞周期关键调控蛋白Skp2（S-phase kinase-associated protein 2，Skp2）的水平，以阐明雌激素调节支持细胞增殖的分子机制。本研究不仅可以为深入认识雄性性腺发育的分子机制，丰富生殖内分泌领域的知识提供基础数据；而且也可以为人工调控支持细胞的增殖、延长移植器官的存活时间奠定基础。

睾丸支持细胞在哺乳动物的精子生成中具有支持和营养的功能，研究其增殖能力对于提高雄性动物的生殖能力具有十分重要的理论和实践意义。雌激素在睾丸支持细胞增殖中发挥了十分重要的作用，但其作用机制仍不清楚。本项目以仔猪为研究对象，利用体内体外模型，开展了以下几个方面的研究：.（1）仔猪睾丸支持细胞在体内的增殖与发育 以7、21 和35 d 仔猪为材料，利用细胞直接计数、免疫组织化学、流式细胞术和免疫印迹分析了仔猪睾丸支持细胞、生精细胞数量和增殖能力变化以及支持细胞的成熟分化状况。.（2）雌激素对体外培养睾丸支持细胞周期的影响 采用流式细胞术测定了细胞周期中DNA 含量，分析了细胞周期细胞增殖指数（PI） 和S 期细胞指数(SPF) 的变化。.（3）17β－雌二醇调节支持细胞增殖的信号通路　利用体外培养的支持细胞，，通过添加各种蛋白酶的抑制剂，采用Western blot、定量PCR等技术，研究重点研究ERK、PI3K/Akt和mTOR信号通路的作用。.（4）17β－雌二醇对细胞周期调节蛋白和基因表达的影响；利用体外培养的支持细胞，采用Western blot检测蛋白的表达水平、定量PCR检测相关基因的表达，研究Skp2, p27Kip1, Cyclin E/CDK2和Rb表达的影响。.（5）FSH和17β-雌二醇联合作用对SkP2表达的影响；利用体外培养的支持细胞，研究了FSH和17β-雌二醇联合作用是否通过ERK级联影响SkP2表达。.（6）AMPK调节雌激素诱导仔猪睾丸支持细胞增殖的机制。为了研究支持细胞中是否存在抑制细胞增殖的机制，本实验研究了AMPK的作用。利用体外培养的支持细胞，利用激动剂和抑制剂处理细胞，miRNA测序，靶基因预测和定量PCR验证，筛选出与AMPK表达相关的miRNA。最后通过miRNA细胞转染，利用Western blotting检测AMPK磷酸化活性的变化。.结论：.（1）尽管在出生后1 个月左右仔猪睾丸支持细胞有较强的增殖能力，但由于这一时期的支持细胞没有分化成熟，因此，不能支持生精细胞的进一步发育。.（2）17β- 雌二醇对细胞周期的调节呈现一定的时间- 剂量依赖性，cAMP 和ERK1/ 2 级联参与了这一过程。.（3）17β-雌二醇通过ERβ 激活cAMP和ERK，通过GPR30、SRC影响PI3K/Akt激活，ERK和PI3K/Akt