球化交联酶聚集体-氧化硅杂化生物催化剂的可控制备及催化特性

Cross-linked enzymes aggregated (CLEAs) technique had been successfully applied in the preparation of carrier-free immobilized enzyme. Nevertheless, the poor controlling of the particle morphology and size, poor mechanical property, and poor stability of the CLEAs have hampered its wide applications. To solve the above-mentioned problems, the combination of the CLEAs, Spherezyme, membrane emulsification and biomimetic silicification techniques will be proposed in this project. Firstly, CLEAs microspheres will be prepared by using conventional emulsification method; Secondly, to control the microsphere size and uniformity, membrane emulsification will be adopted in this project; Thirdly, Poly-L-lysine (PLL) will be intruduced in the preparation process to protect the activity of enzyme; Forthly, to improve the mechanical property and stability of CLEAs, the hybrid biocatalyst CLEAs-silica will be prepared by the combination of CLEAs and biomimetic silicification. In this project, nitrile hydratase will be chosen as the model enzyme, which can be used as a catalyst for the enzymatic production of acrylamide. The results of this project will provide novel theoretical basis and technical support for the rational design of immobilized enzyme and the applications of multienzyme system. Additionally, the utilization of membrane emulsification for the preparation of CLEAs microspheres will open up a new avenue for enzyme immobilization.

针对交联酶聚集体（CLEAs）存在的可控制备性差、机械强度低、稳定性差等问题，通过CLEAs、球化酶（Spherezyme）、膜乳化、仿生硅化等技术的有效结合，设计制备新型生物催化剂：提出球化CLEAs概念，通过传统乳化制备球形CLEAs；引入膜乳化技术，实现粒径均一球形CLEAs的可控制备；在CLEAs制备过程中引入聚赖氨酸（PLL）等来降低酶活损失，并依靠PLL等的诱导硅化功能，在CLEAs上沉积纳米氧化硅，提高CLEAs的机械强度和稳定性；以腈水合酶催化制备丙烯酰胺为模型物系, 解决现有工艺中酶稳定性差等缺点。本课题研究成果将为新型固定化酶设计与制备提供新的理论与方法，促进酶催化的工业化应用，还可为多酶CLEAs的构建奠定基础。本课题将膜乳化引入固定化酶的制备过程，深入研究膜乳化过程中的规律，使膜乳化成为固定化酶领域的一种通用技术，具有较强的理论研究意义和实用价值。

本项目通过交联酶聚集体技术（CLEAs）、球化酶（Spherezyme）、仿生硅化等技术的有效结合，设计制备了新型生物催化剂。提出了球化CLEAs的概念，通过乳化制备球形CLEAs，实现了粒径均一球形CLEAs的可控制备；在CLEAs制备过程中引入纳米二氧化硅，提高了CLEAs的机械强度和稳定性；以腈水合酶催化制备烟酰胺为模型物系，解决了现有工艺中酶稳定性差等缺点。.主要研究内容如下：(1) 利用CLEAs技术，对腈水合酶进行固定化。优化了沉淀剂种类、沉淀剂用量、交联剂用量和交联时间等条件，获得腈水合酶交联酶聚集体，酶活回收率为49.63%。与游离酶相比，固定化酶有更好的pH、热稳定性和储藏稳定性，对高浓度底物的耐受性也明显提高。利用球化酶技术制备了蛋清蛋白微球，并用葡聚糖醛将酶交联在蛋白球外部。经条件优化，制备了粒径在8-20 μm的球化酶，酶活回收率超过50%。球化酶有更高的稳定性和底物耐受性。(2) 进行了仿生氧化硅包埋固定化腈水合酶的制备及性能研究。以正硅酸甲酯为前驱体，聚二甲基二烯丙基氯化铵为催化剂，温和快速地实现了腈水合酶的固定。固定化酶的颗粒直径约为100 nm，包埋率高于98.0%，酶活回收率为26.7%。与游离酶相比，固定化酶的热稳定性、pH稳定性、重复使用稳定性和储藏稳定性均有明显提高。(3) 以鞣酸（Tannic acid）为模板剂制备介孔氧化硅纳米颗粒（Tannic-acid-templated Mesoporous Silica Nanoparticles，TA-MSNPs），并将其作为载体固定化腈水合酶。所得固定化酶的最适温度为40 oC，最适pH为7.0，与游离腈水合酶相比，表现出了较高的热稳定性、pH稳定性、机械稳定性和储存稳定性。(4) 将所得固定化酶应用在烟酰胺的生产中，优化了酶用量、反应时间等条件。相较于游离腈水合酶，固定化酶在烟酰胺的制备中展现出较高的底物耐受性和重复使用性，实现了烟酰胺的酶促制备。并进一步研究了游离和固定化腈水合酶的动力学性能。本项目不仅为固定化酶设计与制备提供了新的理论与方法，促进酶催化的工业化应用，还为多酶CLEAs的构建奠定了基础。所获得的新型固定化酶方法具有普适性。本项目具有较强的理论研究意义和实用价值。