积雪草酸靶向线粒体外膜VDAC1对抗细胞损伤的机制研究

Asiatic acid is the main active ingredient of Centella asiatica with a broad variety of pharmacological effects. But so far, the target of asiatic acid is still unclear. The findings of our group and other teams showed that the pharmacological activities of asiatic acid were associated with mitochondrial protection. Based on further research, we found that asiatic acid can act directly on outer mitochondrial membrane（OMM）, preventing voltage dependent anion channel 1 (VDAC1) oligomerization. In addition, the results of molecular docking showed that asiatic acid can bind to VDAC1 at Lys15 in the N-terminal and at Glu206 and Gln229 in the β-barrel. According to preliminary results, we speculate that asiatic acid may act directly on VDAC1, causing the decrease of mitochondrial outer membrane permeability by affecting the structure and function of VDAC1 and protecting against cell injury. To test this idea, the project intends to conduct the systematic investigation on interaction between asiatic acid and VDAC1 for the first time. The influence of asiatic acid on the structure and function of VDAC1 will be studied at the molecular, subcellular, cellular levels to comfirm the direct molecular target of asiatic acid on preventing mitochondrial dysfunction and protecting against cell injury. Results of this study will provide experimental basis for clinical applications of asiatic acid as the mitochondrial protective agent and, more importantly, will establish technical basis for the future development of mitochondrial protective agent targeting VDAC1.

积雪草酸是益智中草药积雪草的主要活性成分，具有多种重要药理活性。但迄今为止，积雪草酸的作用靶点还不清楚。本课题组和其他团队的研究结果均显示积雪草酸的药理活性与保护线粒体有关。通过进一步研究我们发现积雪草酸可以直接作用于线粒体的外膜，有效防止外膜孔状蛋白VDAC1的寡聚化。另外，计算机模拟分子对接的结果也显示积雪草酸能和VDAC1 N-末端 Lys-15以及β环状结构上Glu-206和Gln-229位点直接结合。根据前期结果，我们推测积雪草酸可直接作用于VDAC1，通过影响VDAC1结构和功能，降低线粒体外膜通透性，抑制细胞损伤。为了验证这一构想，本项目拟首次对积雪草酸和VDAC1的直接作用进行系统的研究，试图从分子、亚细胞、细胞三个水平阐明积雪草酸对VDAC1结构和功能的影响，确定积雪草酸保护线粒体对抗细胞损伤的作用靶点，为积雪草酸的临床应用提供实验依据，并为研发新型线粒体保护剂提供理论指

积雪草酸具有多种重要药理活性，但其确切的作用机制目前还不清楚。本课题组的前期研究提示积雪草酸和VDAC1可能存在直接的作用。因此在本研究中，我们首先制备了鼠源和人源的VDAC1蛋白，通过等温滴定量热法和微量热泳动仪研究了积雪草酸和VDAC1的相互作用。结果提示，VDAC1与积雪草酸没有直接的相互作用。随后，我们深入研究了积雪草酸对线粒体功能的影响。当分离的小鼠脑和肝线粒体经过积雪草酸处理后，四态呼吸速率明显提高，呼吸控制率降低，线粒体膜电位和ATP水平的也明显下降，而细胞色素C的释放增加。此外，积雪草酸还能抑制线粒体肿胀和线粒体呼吸产生的ROS。上述结果表明，积雪草酸能直接作用于线粒体，是一种线粒体解偶联剂。和经典的质子型解偶联FCCP相比，积雪草酸是一种温和的非质子型解偶联剂，能诱导线粒体缓慢解偶联。在细胞水平上，高剂量的AA可诱导线粒体膜电位的快速下降，从而诱导细胞快速死亡；低剂量的AA能够促进细胞的呼吸耗氧和葡萄糖摄取，提示AA在细胞水平的解偶联作用。通过抑制解偶联蛋白或抑制腺嘌呤核苷酸转运体可减弱AA的解偶联作用，初步说明了AA的解偶联机制。通过制备大鼠肝缺血再灌注模型和肝线粒体缺氧复氧模型，首次研究了积雪草酸对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及相关线粒体机制。AA处理可显著减轻大鼠肝I/R引起的肝损伤，作用机制与减轻线粒体氧化应激损伤有关。进一步研究发现，积雪草酸能够有效的抑制由于再灌注诱导的反向电子传递在线粒体复合物I上产生的大量ROS。在离体大鼠肝线粒体缺氧复氧损伤模型上，积雪草酸减轻线粒体的损伤可能也与减轻反向电子传递诱导的ROS有关。AA 可能通过温和的解偶联作用抑制反向电子传递诱导的ROS 产生，减轻氧化应激损伤，有效保护线粒体功能。利用DARTS技术确定了氨甲酰磷酸合成酶1是积雪草酸在小鼠肝线粒体上的直接作用靶点。高剂量的AA可以通过抑制该靶点活性，抑制肝细胞的尿素循环。