定向自组装腈水解酶交联酶聚集体的制备及催化特性研究

Cross-linked enzyme aggregates(CLEAs) is a new type of carrier-free immobilized enzymes, which has a relative high enzyme load and enzyme activity. Low-cost CLEAs can be easily synthesized using crude enzyme. However, as the typical CLEAs is amorphous aggregate, where the cross-linked enzyme molecules distribute randomly and the aggregate sizes vary significantly, the catalytic efficiency, enzyme recovery and mass transfer of CLEAs are hindered. Accordingly, in this project we propose a new idea of introducing protein self-assembly into the synthesis of CLEAs. We plan to design and synthesize novel CLEAs nanocomposites (self-assembled CLEAs) using the nitrilase with industrial potential as templates; the site-specific mutagenesis, novel cross-linking agents and functionalized nanoparticles will be introduced into the synthesis process. The structural characters, enzymatic properties and self-assembly statuses will be investigated using AFM and CLSM system. Then the catalytic mechanism, self-assembly mode and structure-activity relationship of self-assembled CLEAs will be studied and discussed; the theoretical foundation of self-assembled CLEAS can thus be established. This project will develop a new type of CLEAs, help to overcome its inherent defect, and further benefiting the applications of CLEAs in biocatalysis.

交联酶聚集体（CLEAs）是新型无载体固定化酶，它具有高酶负载量和单位酶活，对酶的纯度要求不高、操作简便、成本低等特点。但常见的CLEAs呈无定形聚集体，内部酶分子排布无序，制剂粒径差距悬殊，这影响了CLEAs的催化效率、回收率和传质，也限制了它的产业化应用。对此本项目提出了将蛋白质定向自组装引入CLEAs构建过程中的新思路。以实验室前期筛选的具有工业化应用潜力的腈水解酶作为模式酶，拟采用酶蛋白定点突变，引入新型交联剂和纳米结构辅助自组装等方法，构建新型腈水解酶CLEAs纳米复合结构（自组装CLEAs）；运用原子力显微镜、激光扫描共聚焦显微镜等实验手段，考察其结构特性、酶学性质、自组装状态；进而探讨自组装CLEAs的催化机理、形成规律和构效关系，建立蛋白自组装应用于CLEAs技术的理论支撑。本研究将开发制备CLEAs的新方法，有助于解决CLEAs的固有缺陷，促进其在生物催化产业中的应用。

本项目“定向自组装腈水解酶交联酶聚集体的制备及催化特性研究”以腈水解酶的自组装和固定化为研究对象，系统研究了腈水解酶结构与功能的关系、腈水解酶的自组装行为、腈水解酶的固定化等问题，以多种新型材料为载体，采用交联酶聚集体等多种固定化方法，开展了腈水解酶的定向自组装固定化研究。通过本项目的研究，基本明确了腈水解酶AcN（Acidovorax facilis ZJB09122 nitrilase，GenBank No. KJ001820）的自组装情况，包括其主要以二聚体形式存在的催化活性单位，二聚体内单体直接结合的“A”界面等关键界面，界面上存在的影响二聚体稳定性的F201/A205/C223等关键氨基酸残基，以及经过改变关键残基，能够直接影响二聚体之间的聚集形态，进而改变腈水解酶AcN的催化活性和稳定性。此外，通过在腈水解酶AcN分子上添加增加其可溶性的肽段GKGKG和连接臂等，能够在不影响腈水解酶的催化活性、聚集状态的前提下，显著减少其包含体的生成，增加其可溶性。在这些研究的基础上，通过腈水解酶的定向自组装，制备了定向自组装固定化交联酶聚集体（CLEAs）和交联细胞聚集体（CLCAs），并应用于加巴喷丁中间体1-异氰基环己基乙腈（1-CN）到1-异氰基环己基乙酸（1-CA）的生物转化过程中。项目在理解区域选择性腈水解酶构效关系的基础上，揭示了其自组装机理，探索并开发了基于自组装的理性设计方法，实现了基于自组装的腈水解酶理性设计；开发了腈水解酶的定向自组装固定化酶，并总结了其制备方法，为开发具有工业潜能的固定化腈水解酶及制剂提供了理论依据和技术基础。相关工作发表SCI论文7篇，国内核心期刊1篇，申请公开专利3项，达到了项目的预定目标（在国内外学术期刊上发表3-4篇SCI论文，申请专利2-3项）。