新型多孔化交联酶聚体的制备、表征及生物催化制肽应用

针对酶催化时的活性与稳定性问题，对交联酶聚体(CLEA)技术进行多孔化改性，以解决CLEA应用中大粒径(操作性)与高比表面积(高活性)不可兼得的矛盾和无法催化大分子底物反应的难题。研究中1.以淀粉为致孔剂，与蛋白酶共混沉淀，再经酶解去除，完成造孔改性，经条件优化获得高活性、高稳定性的多孔化CLEA，为工业生物催化提供一种新颖、高效、实用的固定化酶形式；2.综合运用组合电镜、激光粒度分析、体积排阻色谱、动态光散射等多种实验测试方法对此类纳微米生物催化剂进行形貌表征与结构测定，并系统分析CLEA结构与性能的关系，为纳微尺度的酶反应规律解析提供理论参考；3.设计和优化多孔化CLEA微柱与酶膜两套反应器系统，并进行动力学建模与过程模拟，实现对重要产肽体系酪蛋白-胰酶的酶解肽谱高通量分析和酪源活性多肽的连续高效制备。上述研究还可应用于手性合成、天然产物转化等生物催化过程。

本项目针对生物催化转化中酶的稳定性与高活性问题，将纳米技术与生物技术结合，制备纳微米生物催化剂，综合酶工程、化学工程、材料科学、分析化学等领域的理论知识和实验方法，提出造孔、固载、糖类保护3种新颖的CLEAs改性方法，为工业生物催化提供实用的酶稳定化技术，并成功应用于低聚糖、活性多肽、抗生素的酶法制备及蛋白质组学分析，相关工作亦可为微反应器设计、蛋白解析等领域提供一项有益的新技术，并为纳微米尺度酶反应规律与传质特性剖析等基础科学问题提供理论参考。具体研究中.1.获得了多种酶蛋白CLEAs的制备工艺，制得活性与稳定性理想的CLEAs生物催化剂。.2.建立了一套表征CLEAs性质的方法，包括：SEM与TEM成像、激光粒度分析、DSL分析、FTIR解析与CLSM分析等，获得了酶蛋白结构信息，完成了CLEAs中酶与底物作用机制与酶性能的剖析评价。.3.针对CLEAs催化大分子底物传质效率低的问题，以木瓜蛋白酶为模型酶，利用淀粉作为致孔剂，经共沉淀-交联-除致孔剂，实现CLEAs的造孔化改性，获得高活性、高稳定性的多孔化CLEAs；并将其应用于大分子蛋白及多糖底物的酶法降解，大幅提高了反应效率。.4.针对CLEAs技术在工业应用时大颗粒需求与高催化效率不可兼得的矛盾，提出在氨基改性的大孔硅胶孔道内，经酶吸附-沉淀-共交联，“一步法”制备固载化木瓜蛋白酶CLEAs的新方法，提高了酶的操作及回收稳定性；并将其应用于丙谷二肽前体的酶法合成，达到与游离酶相当的催化效率。.5.针对传统CLEAs制备过程中酶活损失大的缺陷，提出在沉淀步骤加入糖类物质以提高CLEAs酶活的新方法。借助SEM、CLSM、FTIR及催化反应动力学等多种分析手段，揭示了糖的作用符合“水替代”机制；并将所得青霉素酰化酶CLEAs应用于抗生素阿莫西林的酶法合成，提高了反应选择性及收率。.6.将CLEAs技术拓展应用于蛋白组学的酶解肽谱分析中，以“模型蛋白-胰蛋白酶CLEAs”为研究体系，证实了CLEAs可有效防止蛋白酶的自水解，避免自水解多肽对后期质谱检测的影响，结合高温辅助和板上酶解策略，大幅提高了分析通量和序列覆盖度。.研究成果发表SCI论文14篇（11种学术刊物），申请发明专利4项，授权1项。培养博士生2名、硕士生6名；参加国内外学术会议14次，口头报告/墙报展示6次。