TMEM196基因在化学致肺癌过程中的DNA甲基化调控和功能研究

TMEM196 gene is a hypermethylated gene screened previously by applicant in the process of research about chemical-induced lung cancer. Further research found that promoter methylation and loss of TMEM196 gene expression occur in chemical-induced rat lung cancer tissues, human lung cancer tissue and a series of cell lines. However, this gene with unmethylated express in normal lung tissues. Results of previous research suggest that this gene regulated by DNA methylation may play an important role during lung carcinogenesis. However, related research about TMEM196 gene expression regulation and function has not yet been reported in the literature. On the basis of chemical-induced rat lung cancer model established previously, this study will detect the status of TMEM196 gene methylation, mRNA and protein expression during rat lung carcinogenesis, combined with demethylation drug treatment experiment, to clarify DNA methylation regulation mechanism for TMEM196 gene expression during chemical-induced lung carcinogenesis. Then, through construction of TMEM196 gene expression reconstruction and silence cell model combined with nude mouse tumorigenicity assays in vivo, we will explore the biological functions of the gene in cells growth, apoptosis, cycle, migration, and further validate in chemical-induced animal model. It is of great significance for clarifying the machanism of chemical carcinogenesis and the pathogenesis of lung cancer. The study will lay the foundation for comprehensive study on TMEM196 gene function in the role of signal pathway, growth and development, disease occurrence and other aspects.

TMEM196基因是申请者前期在研究化学物致肺癌过程中筛选出的高甲基化基因。进一步研究发现，该基因在大鼠和人肺癌组织以及多种肺癌细胞株中均发生高甲基化且表达缺失，而在正常肺组织中未发生甲基化且高表达，提示该基因受DNA甲基化调控，可能在癌变过程中发挥重要作用。经文献检索，尚未见有关该基因表达调控机制和功能的报道。本研究拟在前期建立化学致肺癌模型的基础上，检测癌变各阶段TMEM196基因甲基化、mRNA和蛋白表达水平，结合去甲基化药物处理实验，阐明该基因在化学致肺癌过程中的DNA甲基化调控机制；构建该基因过表达和沉默细胞模型，结合体内裸鼠成瘤实验，从细胞增殖、凋亡、周期、迁移等方面分析该基因在肺癌发生中的主要生物学功能，并在化学致癌模型中进一步验证。本项目不仅对阐明化学致癌和肺癌发病机制具有重要意义，而且为深入研究TMEM196基因在信号通路、生长发育、疾病发生等方面的作用奠定了坚实基础。

新近研究表明DNA甲基化不仅有助于阐明化学物毒性作用机制，而且可作为表观遗传生物标志物并用于肿瘤的早期诊断、易感人群的筛查及化学物的危险度评估。因此，以DNA甲基化为代表的表观遗传调控已成为化学致癌研究的热点和前沿。TMEM196基因是课题组前期在研究化学物致肺癌过程中筛选出的高甲基化基因，但在肺癌发生过程中其表达调控机制和功能目前还不清楚。本研究拟在化学致肺癌模型以及人肺癌组织和细胞株标本中检测该基因甲基化和表达水平，结合去甲基化药物处理实验，阐明该基因在化学致肺癌过程中的表达调控机制；构建该基因过表达和沉默细胞模型，结合体内裸鼠成瘤实验，分析该基因在肺癌发生中的主要生物学功能。我们的研究发现TMEM196基因在正常大鼠支气管上皮细胞没有发生甲基化且高表达，而在化学物诱导大鼠癌变过程中甲基化频率逐渐升高而基因和蛋白表达呈现逐渐下降趋势，二者之间存在显著负相关。进一步研究发现该基因在肺癌组织中甲基化检出率为61.2%，而在正常肺组织中均未发生甲基化。TMEM196基因甲基化与肿瘤临床分期以及分化程度密切相关。在10例肺癌细胞株中均可检测出TMEM196基因甲基化且表达下降或缺失，而在正常肺上皮细胞株中未检测出甲基化且表达正常。去甲基化实验进一步证实TMEM196基因直接负调控其基因表达。我们构建了TMEM196高表达的细胞模型，证实了TMEM196高表达可以明显抑制肿瘤细胞增殖和克隆形成，诱导细胞凋亡和周期阻滞；而利用siRNA降低TMEM196基因的表达后，这些效应得到恢复。裸鼠成瘤实验证实该基因在体内也具有抑制肿瘤细胞生长的作用。TMEM196基因可能通过调控p21、Bax、cyclinD1、c-myc、CD44、β-catenin等基因的表达发挥抑癌作用。生存分析结果发现，TMEM196蛋白高表达的肺癌患者生存时间更长。Cox回归模型进行多因素校正分析发现，TMEM196蛋白表达是肺癌的一个独立的预后因子。本项目研究结果表明TMEM196基因在体内外均可抑制肿瘤细胞生长，是一个受DNA甲基化调控的候选抑癌基因。本项目不仅对阐明化学致癌和肺癌发病机制具有重要意义，而且为深入研究TMEM196基因在信号通路、生长发育、疾病发生等方面的作用奠定了坚实基础。