克隆和半克隆胚胎发育的表观遗传调控研究

Nuclear transfer has offered exciting promises in basic and applied research. Cloned embryos generated from traditional nuclear transfer procedure developed to term in vivo at very low efficiency. Meanwhile, the cloned animals showed large offspring syndrome. Recently, we established androgenetic haploid embryonic stem cells (AG-haESCs) and semicloned technology by injection of AG-haESCs into oocytes. Interestingly, the developmental efficiency of semi-cloned embryos was also very low and half of semi-cloned mice were developmentally retarded at birth. The abnormally developmental phenotypes of cloned and semicloned mice provide a new model for the study of epigenetic mechanisms involved in embryonic development. Previous studies have shown that abnormal X inactivation and expression of imprinted genes might account for developmental failure or abnormal development of cloned and semicloned embryos. Here, we are planing to investigate the roles of X inactivation and expression of imprinted genes (such as H19) in the development of cloned and semicloned embryos. We will describe the patterns of X inactivation and expression of H19 in cloned and semicloned embryos and regulate the X inactivation and expression of H19 to see whether the development of cloned and semicloned embryos will be affected. We believe that these studies will not only aid our understanding of the epigeneitc mechanisms involved in embryonic development, but also may yield clues to improve the developmental efficiency of cloned and semicloned embryos.

核移植技术具有重要的理论和实践意义，传统核移植方法获得的克隆胚胎发育率低，发育到期的克隆动物存在个体偏大的现象。我们最近建立了孤雄单倍体胚胎干细胞和通过将这些细胞注入卵母细胞中的半克隆技术，发现半克隆胚胎发育率低，发育到期的半克隆小鼠有一半存在个体偏小的现象。克隆技术和半克隆技术产生的胚胎发育异常现象为研究胚胎发育的表观遗传调控提供了新的手段。已有的结果表明，X染色体失活异常和印记基因的表达异常可能与克隆和半克隆胚胎的发育异常有关。本项目将围绕X染色体失活和印记基因（如H19）的表达在克隆和半克隆胚胎发育中的作用开展研究，研究X染色体失活和H19基因在克隆和半克隆胚胎中的表达规律，通过调节X染色体失活和H19基因的表达水平来改变克隆和半克隆胚胎的发育潜能。希望通过这些研究提高克隆和半克隆胚胎发育效率，同时揭示与胚胎发育相关的重要的表观遗传学调控机制。

通过集成项目支持，发表研究论文8篇，应邀综述3篇，获授权专利1项，申请专利2项，取得以下重要进展：（1）建立并完善“类精子细胞”与半克隆技术。2012年，我们建立了只携带精子来源遗传物质的小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞，并证明这一细胞能代替精子在注入卵母细胞后能支持胚胎发育产生健康的半克隆小鼠，即半克隆技术。然而，单倍体细胞的“受精”能力随着细胞的传代逐渐丢失，特别是经过基因编辑后，这些细胞再注入卵子中很难获得健康半克隆小鼠。在本项目的支持下，通过将调控雄性印记基因H19和Gtl2表达的H19-DMR和IG-DMR敲除后获得了能稳定产生半克隆小鼠的“类精子细胞样”的单倍体细胞，并证明它们能稳定高效支持获得遗传修饰的半克隆小鼠。重要的是，这些“类精子细胞”细胞携带CRISPR-Cas9文库，能够一步产生大量的携带不同突变基因的小鼠，从而为开展小鼠个体水平的遗传筛选提供了技术支持。进一步，证明卵子来源的单倍体细胞在去除H19-DMR和IG-DMR后，同样具备了“类精子细胞”的能力，从而在哺乳动物中实现了高效的孤雌发育。另外，还建立了来着人卵母细胞的孤雌单倍体胚胎干细胞。这些研究成果在《Cell Stem Cell》和《Cell Res》上发表论文3篇。申请专利2项。（2）证明CRISPR-Cas9能高效用于遗传疾病治疗。我们首先将CRISPR-Cas9直接注入携带白内障遗传缺陷的受精卵中后治愈了小鼠的白内障遗传缺陷。而这种通过直接胚胎注射的方法存在两个问题：一是新生小鼠被治愈的机率较低，约为30%；二是存有少量实验脱靶现象。为解决这些问题，我们从白内障小鼠的睾丸中获取了携带纯和遗传突变的精原干细胞并通过CRISPR-Cas9修复遗传缺陷，建立了一系列来自单个精原干细胞的细胞系。随后，对这些细胞系进行了深入分析，选择满足突变位点均已修复、不存在脱靶问题并维持正常的表观遗传特性的“优质”细胞移植到体内，获得了100%完全健康的小鼠。这一研究成果为人类基因治疗提供了一条新的思路。这些研究结果以在《Cell Stem Cell》和《Cell Res》上发表论文2篇。