一种新的SELEX策略筛选海葵溶细胞素核酸适配体及功能研究

Cardiovascular damage can be caused by cytolysin when people were stung by the sea anemone , but there is no effective strategy for detection, prevention and treatment. Our group has isolated a novel cytolysin GT-4 and selected several of aptamers tageted marine toxins. This project is ready to establish a biological function-SELEX strategy, and develop a rapid detection method for GT-4 based aptasensor.. In this study, specific and high-affinity ssDNA aptamers binding to GT-4 will be screened in red blood cell suspension by function-SELEX strategy with low concentration of GT-4 could bind to erythrocyte membrane. As a recognition element, it will be used to combine bio-layer interferometry and label-free aptasensor to establish a novel, sensitive and rapid detection method for GT-4. While, the antagonize application of aptamers to GT-4 will be analyzed at the cellular level and in vivo.. This project will not only establish a function-SELEX strategy for GT-4, but also provide a novel, sensitive and rapid detection methods for GT-4. Aptamers have the potential to develop as a drug, which also provides a new strategy for the prevention and treatment of GT-4 poisoning.

海葵蛰人后释放的溶细胞素可引心血管损伤，目前没有快速有效的手段进行检测、防护和治疗。本项目在前期分离到一种新型海葵溶细胞素GT-4及已筛选出多种海洋生物毒素适配体的基础上，拟建立一种以生物学功能为导向的适配体筛选策略并进行毒素检测及防治的研究。. 本研究首先以重组表达并纯化的GT-4为靶标，利用低浓度的GT-4能结合红细胞(RBC)膜的特性，以红细胞悬液模拟复杂的筛选体系，筛选出特异性的、高亲和力的并具有拮抗功能的GT-4适配体，将其作为识别元件，结合芯片及生物膜干涉技术技术制备免标记传感器，构建新颖、灵敏、快速的GT-4检测方法。同时从细胞水平和动物体内开展适配体拮抗GT-4毒性的功能研究。. 本项目的开展不仅能建立基于功能-SELEX的适配体筛选策略，同时建立基于生物传感器的快速检测GT-4的方法，得到的适配体还具有开发为药物的潜力，对于海葵蛰伤的防护和治疗提供先导化合物。

有毒海葵蛰伤、腹泻型贝类毒素引起的食物中毒以及创伤弧菌引起的伤口感染，都是常见的海洋生物伤，对于人类健康和海洋渔业造成了严重威胁。现有的毒素检测方法都存在各种各样的不足，因此急需建立新颖、快速的检测方法。核酸适配体是一种新兴的分子识别元件，其与靶标的结合模式类似于抗体，将适配体作为传感器的核心，与各种技术平台相结合，开发出多种新型检测方法，具有广泛的应用前景。. 本研究首先结合磁分离富集技术建立一种新型的的筛选适配体的方法，将得到的高亲和力和特异性的适配体作为识别元件，结合生物膜干涉技术技术制备免标记传感器，构建新颖、灵敏、快速的检测方法。同时利用计算生物学探讨适配体与靶标相互作用的空间构象和结合位点。. 通过X-aptamer筛选方法获得了海葵溶细胞素GT-4的特异性结合适配体apt-g4a(KD=13.7nM)，在此基础上成功制备了适配体生物传感器，其线性检测范围为20-800nM，最低检测限为0.43nM，通过分子动力学模拟，GT4与apt-gt4a的平均结合自由能为-104.27±1.33(kcal/mol)。运用磁珠法筛选获得了鳍藻毒素DTX-1特异性结合的最佳适配体N59（KD=170nM），进行了截短优化，得到核心区域为N59a(KD=64nM)，制备了适配体生物传感器，线性检测范围为60-200nM，检测限为614pM，在海水样品中该传感器依然能保持较高的回收率(100.5%-106.9%)和较低的变异值(1.2%-5.2%)。筛选获得与创伤弧菌特异性结合的核酸适配体V8(KD=11.2nM)和V13(KD=15.4nM)，建立了适配体V8联合流式细胞直接对液体样本进检测行创伤弧菌的方法。与传统方法比耗时短，理论检测限为29.7CFU/mL，可靠检测限为100CFU/mL，线性范围为500-500,000CFU/mL。此外，通过计算生物学发现，岩沙海葵毒素PTX通过与适配体P-18S2的顶部碱基形成密集的氢键网络，增强了稳定性。. 综上，获得了2种海洋生物毒素和1种海洋致病菌的高特异性高亲和力的适配体，通过结构预测和计算优化结构，结合BLI技术和流式细胞术建立了快速、灵敏的检测方法，为食品安全和环境保护提供了新的检测方法，为降低海训、海洋作业中的减员失能提供保障。